Monitorização e modelação da fermentação de E. coli recombinante

Abstract

O presente trabalho visou optimizar as condições ambientais de fermentação de forma a maximizar a produção de proteína fluorescente (EYFP – Enhanced Yellow Fluorescent Protein) pela bactéria Escherichia coli M15. Para atingir os objectivos deste projecto, foi utilizada a metodologia de planeamento factorial, sendo a análise dos dados experimentais efectuada com o auxílio de um programa estatístico (Design Expert, Versão 5.0). Uma vez que um dos objectivos era avaliar qual a fase de crescimento, no momento da indução da produção de EYFP, que proporcionava maior produção de intensidade de fluorescência por E. coli recombinante, foram efectuados dois planeamentos factoriais 2 2 , com repetição no ponto central. No primeiro planeamento, a indução da produção de EYFP foi efectuada no início da fase exponencial de crescimento e no segundo planeamento factorial a indução da produção de EYFP foi efectuada no meio da fase exponencial de crescimento. Os factores ambientais estudados foram a temperatura de fermentação e a concentração de oxigénio dissolvido, sendo as respectivas regiões de estudo de 27ºC até 40ºC e 15% até 40% de saturação. De forma a caracterizar todo o processo fermentativo foram analisadas as seguintes respostas: taxa especifica máxima de crescimento, rendimento em biomassa, e produção máxima de fluorescência arbitrária e normalizada. Foi verificado que a fase de crescimento na qual é efectuada a indução da produção da proteína afecta a quantidade de fluorescência final obtida, obtendo-se, para as melhores condições de temperatura de fermentação e concentração de oxigénio dissolvido (33,5ºC e 27,5%), a fluorescência máxima média de 70 577 AFU quando a indução é efectuada no meio da fase exponencial de crescimento, o que representa um aumento de 5 263 AFU comparativamente com o máximo obtido quando a indução se efectua no início da fase exponencial de crescimento. Foi também verificado que a fase de crescimento na qual é efectuada a indução influencia o efeito dos factores temperatura de fermentação e concentração de oxigénio dissolvido nas respostas estudadas. Após a realização dos ensaios experimentais nas condições de temperatura de fermentação e concentração de oxigénio dissolvido definidos para cada ponto do planeamento factorial, foi avaliada a significância estatística e efeito de cada variável independente, bem como o efeito de interacção nas várias respostas estudadas. Posteriormente, cada resposta foi aproximada por um modelo linear e avaliado o seu desempenho. Foi concluído que para todas as respostas, um polinómio de segundo grau era mais adequado para descrever a dependência da respectiva resposta da temperatura de fermentação e concentração de oxigénio dissolvido. Quando a indução da produção de EYFP foi efectuada no início da fase exponencial de crescimento, os valores máximos para as respostas taxa específica máxima de crescimento, rendimento em biomassa e produção de fluorescência arbitrária, foram obtidos para as condições do ponto central (33,5ºC e 27,5%) sendo os seus valores médios de 0,424 h -1 , 0.522 g/g e 65 313,5 AFU, respectivamente. O valor máximo para a produção de fluorescência em unidades normalizadas foi obtido para as condições (+1;+1), isto é, (40ºC, 40%) do planeamento factorial sendo o seu valor de 42 225,8 NFU. Quando a indução da produção de EYFP foi efectuada no meio da fase exponencial de crescimento, os valores máximos para a taxa específica máxima de crescimento e produção de fluorescência arbitrária foram obtidos para as condições do ponto central (33.5ºC e 27.5%), sendo os seus valores de 0.4095h -1 e 70.576,9 AFU. O melhor rendimento em biomassa foi obtido para as condições (27,5ºC, 40%) sendo o seu valor de 0.410 g/g. A produção de fluorescência normalizada foi máxima no ponto (40ºC;40%) sendo o seu valor de 35 689,04 NFU.

This work is focused on the optimization of environmental conditions of recombinant E.coli fermentation for the maximization of recombinant protein production. To achieve those objectives, a factorial design methodology was employed, and experimental data were analysed using a statistical program (Design-Expert, version 5.0). Since the determination of the appropriate growth phase for induction of recombinant protein production was also studied, two 22 factorial design with two replicates in the central point, were made. In the first 22 factorial design, the induction of recombinant YEFP protein production was made in the beginning of the exponential growth phase, while in the second 22 factorial design the induction of recombinant YEFP protein was made in the middle of the exponential growth phase. The environmental factors studied were the temperature of fermentation and dissolved oxygen concentration. The ranges of study were 27ºC to 40ºC for the temperature of fermentation and 15% to 40% for dissolved oxygen, respectively. For the characterization of the fermentative process the following responses were analyzed: maximum specific growth rate, yield of biomass, arbitrary and normalized intensity of fluorescence produced. After analysing the experimental data, it was observed that the growth phase in which the induction was performed affected the amount of final fluorescence obtained (correlated with the amount of recombinant protein produced). It was possible to conclude that the induction in the middle of the exponential growth phase led the best results. The best conditions regarding temperature and dissolved oxygen concentration were 33.5ºC and 27.5%, resulting in a maximum average fluorescence of 70.577 AFU, which represents an increase of 5.263 AFU when compared with the same conditions, but with the induction performed in the beginning of the exponential growth phase. From the same experimental data it could also be verified that the moment when the induction of protein production is performed affects the effect of the factors temperature and dissolves oxygen in the responses of the system studied. The statistical significance and the effects of the independent variables were evaluated, as well as the interaction of the effects between the variables. Afterwards, each response of the system was approximated by a linear model and the model performance was evaluated.