Engineering of specific bacteriophages for α-Synucleinopathies diagnosis

Abstract

As α-sinucleinopatias são doenças neurodegenerativas caracterizadas por depósitos anormais de agregados de α-sinucleína em neurónios ou células gliais, capazes de provocar demência e perturbações do movimento, especialmente em pessoas idosas. De acordo com a ordem de prevalência, as três principais α-sinucleinopatias são a doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy e atrofia de múltiplos sistemas. A acumulação de α-sinucleína nos neurónios, resulta nos chamados corpos de Lewy, que são a marca patológica da doença de Parkinson e demência com corpos de Lewy, enquanto a acumulação de α-sinucleína nas células oligodendrogliais dá origem às chamadas inclusões citoplasmáticas gliais, que são a principal característica da atrofia de múltiplos sistemas. Atualmente, estas α-sinucleinopatias não têm qualquer tipo de tratamento ou diagnóstico precoce, pelo que o desenvolvimento de abordagens para diagnóstico e terapêutica são cruciais. Uma vez que a agregação de α-sinucleína é uma característica de todas estas doenças neurodegenerativas, as estratégias que tenham este biomarcador como alvo podem tornar-se terapias promissoras. No entanto, o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento e/ou diagnóstico é limitado pela barreira hematoencefálica que reveste o sistema nervoso central. Posto isto, a presente proposta teve como principal objetivo desenvolver um sistema baseado em bacteriófagos (vírus de bactérias) capazes de atravessar a barreira hematoencefálica para diagnosticar α–sinucleinopatias, precocemente. Neste trabalho, bacteriófagos filamentosos M13, foram manipulados geneticamente para fazerem o display à superfície de péptidos (4554: KEGVVHGVAT, 4554W: KDGIVNGVKA e 4554WN6A: KDGIVAGVKA) potencialmente capazes de reconhecerem e se ligarem à α-sinucleína. Os fagos de interesse foram obtidos com sucesso por intermédio da combinação do DNA de um fagemídeo modificado com o DNA do fago aulixiar M13KO7. De modo a avaliar a afinidade dos fagos artificiais com a região 45-54 da α-sinucleína e a caracterizar morfologicamente os fagos aquando desta interação, ensaios de caracterização foram realizados. Os resultados obtidos apenas evidenciaram que os fagos exibiam o respetivo péptido de interesse, e que a nível físico e químico apresentaram um tamanho e uma carga condizente com o que era esperado. Resumidamente, pode dizer-se que os fagos foram obtidos com sucesso, o que abre portas a novas linhas de estudo futuras. Esta ferramenta será um ponto de partida para o diagnóstico precoce e para, possivelmente, um tratamento capaz de travar a progressão destas doenças.

α-synucleinopathies are neurodegenerative diseases that primarily affect aging people. These diseases are characterized by abnormal deposits of α-synuclein aggregates in neurons or glial cells, which cause dementia and movement disorders. In line with the order of prevalence, the three main α synucleinopathies are Parkinson's disease, dementia with Lewy bodies, and multiple system atrophy. The accumulation of α-synuclein in neurons results in the so-called Lewy bodies, the hallmark of Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies. In contrast, the buildup of α-synuclein in oligodendroglial cells gives rise to the so-called glial cytoplasmic inclusions, which are the defining characteristic of multiple system atrophy. Currently, these α-synucleinopathies are not early diagnosed and do not have any treatment, so the development of diagnostic and therapeutic approaches is crucial. Since α-synuclein is a pathological hallmark of all these neurodegenerative diseases, the development of strategies with this biomarker as a target can be powerful therapies. However, the development of new treatment and/or diagnostic approaches is limited by the blood-brain barrier that shelters the central nervous system. Therefore, the present proposal aimed to develop a system based on bacteriophages (bacterial viruses) able to cross the blood-brain barrier to early diagnose α-synucleinopathies. In this work, filamentous bacteriophages M13 were genetically manipulated to display at the surface peptides (4554: KEGVVHGVAT, 4554W: KDGIVNGVKA, and 4554WN6A: KDGIVAGVKA) potentially capable of recognizing and binding to α-synuclein. The phages of interest were successfully obtained by combining DNA from a modified phagemid with DNA from the helper phage M13KO7. In order to evaluate the affinity of the engineered phages for the 45-54 region of α-synuclein and to morphologically characterize the phages at the time of this interaction, characterization assays were performed. The results obtained showed that the phages exhibited the respective peptide of interest, and that at the physicochemical level presented a size and charge consistent with what was expected. In summary, it can be said that the phages were successfully obtained, which opens the door to new future lines of study. This tool will be a stepping-stone for early diagnosis and possibly a treatment capable of halting the progression of these diseases.