Eco-innovative bio-based inks for smart applications

Abstract

Nowadays, counterfeiting is a problem that affects many types of production, resulting in countless losses for producers worldwide. While practiced in almost all sectors of industry, the largest economic losses are suffered by the textile and clothing sector. As a result, companies are interested in obtaining and applying trademarks to differentiate between original and counterfeit products. However, with the increasing technological sophistication of the counterfeiting sector, there is a constant need for new unique anti counterfeiting markers that are difficult to duplicate and easy to identify. Thus, the concept of smart inks has emerged as a viable alternative as traceability markers in brand protection. Being the use of more sustainable and environmentally friendly alternatives to the petroleum-based inks traditionally used in the textile industry also on the international agenda, this must be considered when developing new smart ink solutions. Envisioning the development of unique and eco-sustainable anti-counterfeiting markers, inks based on reversibly photoswitchable fluorescent proteins (RSFPs) were previously developed, which displayed improved fastness to wash when encapsulated in silica nanoparticles. To overcome the need for a resource consuming encapsulation step, this work involved the design, cloning, production, and purification through biotechnological means of an innovative RSFP fusion with self-entrapment properties, provided by the ferritin protein from the hyperthermophile Pyrococcus furiosus (PfFtn). PfFtn is known to form cages through a process of self-assembly, even when fused to other proteins, being highly thermostable. After comparative analysis of the fluorescence and thermal stability properties of this and previously constructed RSFP fusions in solution, these proteins were applied to cotton fabric by impregnation using different water-based formulations, namely containing natural or chemical fixing agents such as chitosan or glutaraldehyde, to compare different fixation strategies. The fluorescence properties (namely photoswitching) and fastness to wash and light of functionalized textiles was then characterized, to compared fixation strategies and the performance of the newly developed RSFP fusion with that of silica encapsulated RSFPs and other previously developed RSFP fusions. Considering the results obtained after the design, cloning, production, and purification stages, the new RSFP fusion protein was obtained in the desired form and at adequate amount and purity for subsequent application. Its fluorescence properties did not differ greatly from those obtained with previously constructed RSFP fusions, but its stability on textile substrates was after the various tests proved to be slightly higher than other proteins, considering the levels of fluorescence intensity measured initially. However, in terms of absolute fluorescence signal before and after fastness tests, the RSFP fused to a cotton-binding peptide provided the best results. In addition, when chitosan was used as fixing agent, it was possible to obtain a switchable fluorescence signal on the functionalized substrates even after 36 hours of direct sunlight exposure or 5 wash cycles. Altogether, the results of this thesis tell us that, in the future, the use of these eco-friendly bio-inks could serve as anti-counterfeiting markers not only on textile substrates, but also in other applications such as labels or documents.

Atualmente, a contrafação é um problema que afeta muitos tipos de produção, resultando em inúmeras perdas para os produtores de todo o mundo. Embora praticada em quase todos os sectores da indústria, as maiores perdas económicas são sofridas pelo setor têxtil e do vestuário. Como resultado, as empresas estão interessadas em obter e aplicar marcas registadas para diferenciar os produtos originais dos produtos contrafeitos. No entanto, com a crescente sofisticação tecnológica do sector da contrafação, há uma necessidade constante de novos marcadores anti contrafação únicos que sejam difíceis de duplicar e fáceis de identificar. Assim, o conceito de tintas inteligentes surgiu como uma alternativa viável como marcadores de rastreabilidade na proteção de marcas. Estando a utilização de alternativas mais sustentáveis e amigas do ambiente às tintas à base de petróleo tradicionalmente utilizadas na indústria têxtil também na agenda internacional, este facto deve ser considerado no desenvolvimento de novas soluções de tintas inteligentes. Tendo em vista o desenvolvimento de marcadores anti contrafação únicos e eco sustentáveis, foram anteriormente desenvolvidas tintas baseadas em proteínas fluorescentes reversivelmente foto-comutáveis (RSFP), que apresentaram uma melhor resistência à lavagem quando encapsuladas em nanopartículas de sílica. Para ultrapassar a necessidade de uma fase de encapsulamento que consome muitos recursos, este trabalho envolveu a conceção, a clonagem, a produção e a purificação, através de meios biotecnológicos, de uma fusão inovadora de RSFP com propriedades de auto-aprisionamento, proporcionadas pela proteína ferritina do hipertermófilo Pyrococcus furiosus (PfFtn). A PfFtn é conhecida por formar cages através de um processo de automontagem, mesmo quando fundida com outras proteínas, sendo altamente termoestável. Após análise comparativa das propriedades de fluorescência e estabilidade térmica desta e de outras fusões RSFP previamente construídas em solução, estas proteínas foram aplicadas em tecido de algodão por impregnação utilizando diferentes formulações à base de água, nomeadamente contendo agentes de fixação naturais ou químicos, como o quitosano ou o glutaraldeído, para comparar diferentes estratégias de fixação. As propriedades de fluorescência (nomeadamente a fluorescência comutável) e a resistência à lavagem e à luz dos têxteis funcionalizados foram então caracterizadas, para comparar as estratégias de fixação e o desempenho da fusão RSFP recentemente desenvolvida com o das RSFPs encapsuladas em sílica e outras fusões RSFP previamente concebidas. Considerando os resultados obtidos após as etapas de conceção, clonagem, produção e purificação, a nova proteína de fusão RSFP foi obtida na forma desejada e em quantidade e pureza adequadas para posterior aplicação. As suas propriedades fluorescentes não diferiram muito das obtidas com as fusões RSFP construídas anteriormente, mas a sua estabilidade em substratos têxteis foi, após os vários testes, ligeiramente superior à de outras proteínas, considerando os níveis de intensidade de fluorescência medidos inicialmente. No entanto, em termos de sinal de fluorescência absoluto antes e depois dos testes de solidez, a RSFP fundida com um péptido de ligação ao algodão forneceu os melhores resultados. Para além disso, quando o quitosano foi usado como agente de fixação, foi possível obter um sinal de fluorescência comutável nos substratos funcionalizados mesmo após 36 horas de exposição solar direta ou 5 ciclos de lavagem. No seu conjunto, os resultados desta tese dizem-nos que, no futuro, a utilização destas tintas biológicas poderá servir como marcadores anti-contrafação não só em substratos têxteis, mas também noutras aplicações, como etiquetas e documentos.