Chimeric phages - a new therapeutic approach to target Pseudomonas aeruginosa infections

Abstract

Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria gram-negativa frequentemente associada a uma ampla gama de infeções graves. Uma das principais caraterísticas que contribui fortemente para a sua patogenicidade é a capacidade de aderir a superfícies e formar biofilmes, cuja erradicação é extremamente difícil. Os (bacterió)fagos surgiram como uma abordagem terapêutica promissora para enfrentar o problema mundial da resistência aos antibióticos, e a sua atividade antibacteriana pode ser aprimorada por ferramentas de engenharia de fagos, que permitem a construção de fagos quiméricos com novas funcionalidades. Com base nesta suposição, foram construídos fagos portadores de genes que interferem nas vias de quorum-sensing (QS) com o objetivo de melhorar as suas propriedades antibacterianas contra P. aeruginosa. Uma versão reduzida do fago PE3 onde genes com função desconhecida (gp1-gp12) foram removidos (PE3Δgp1-gp12) foi usada para a introdução de novos genes com auxílio da plataforma de engenharia de fagos baseada em levedura. Os genes aiiA e pvdQ, que codificam enzimas que interferem no QS, foram trocados pelo gene gp53, resultando nos fagos PE3Δgp1-gp12,gp53:aiiA e PE3Δgp1-gp12,gp53:pvdQ, respetivamente. O potencial antibacteriano dos fagos anti-QS comparativamente ao fago PE3Δgp1-gp12 foi avaliado tanto in vitro como in vivo. Os ensaios in vitro não revelaram diferenças entre PE3Δgp1-gp12 e os fagos quiméricos durante as primeiras 6 h de infeção; no entanto, entre as 6 e 48 h de infeção, a DO das culturas infetadas com o fago PE3Δgp1-gp12,gp53:aiiA foi significativamente menor comparativamente ao fago PE3Δgp1-gp12, indicando uma atividade antibacteriana ligeiramente superior deste fago. Em ensaios de infeção em biofilmes, não foram encontradas diferenças significativas entre o fago PE3Δgp1-gp12 e os fagos quiméricos. Para avaliar o potencial terapêutico dos fagos, foi utilizado um modelo de infeção por G. mellonella. O tratamento das larvas infetadas com o fago PE3Δgp1-gp12,gp53:aiiA resultou em maiores taxas de sobrevivência quando comparado com o fago PE3Δgp1-gp12. No entanto, isto não foi observado para o fago quimérico PE3Δgp1-gp12,gp53:pvdQ. Em conclusão, este trabalho demonstrou que a plataforma de engenharia de fagos utilizada é uma ferramenta eficiente para a construção de fagos quiméricos de P. aeruginosa. Os resultados aqui obtidos revelaram que a construção de fagos anti-QS é possível e com base nas informações recolhidas, novas construções de fagos poderiam ser feitas para alcançar melhor atividade dos mesmos.

Pseudomonas aeruginosa is a gram-negative bacterial pathogen frequently linked to a wide range of severe infections. One of the main characteristics that contribute to the high pathogenicity od this bacterium is its ability to adhere to surfaces and form biofilms, which are extremely challenging to eradicate. (Bacterio)phages have emerged as a promising therapeutic approach to deal with the worldwide problem of antibiotic resistance and their antibacterial activity can be improved by phage-engineering tools that allow the assembly of chimeric phages with new functionalities. Therefore, here chimeric phages carrying genes interfering with quorum-sensing (QS) pathways were assembled aiming to improve their antibacterial properties against P. aeruginosa. A reduced version of phage PE3 where genes with unknown function (gp1-gp12) were deleted (PE3Δgp1-gp12) was used here for the introduction of new genes using the yeast-based phage-engineering platform. The genes aiiA and pvdQ, encoding for QS-interfering enzymes, were swapped with the gene gp53, resulting in phages PE3Δgp1-gp12,gp53:aiiA and PE3Δgp1-gp13,gp53:pvdQ,respectively. The antibacterial potential of anti QS phages comparatively to PE3Δgp1-gp12 phage was assessed in vitro as well as in vivo. In vitro experiments revealed no differences between PE3Δgp1-gp12 and chimeric phages during the first 6 h of infection; however, between 6 and 48 h of infection, the OD of cultures infected with PE3Δgp1-gp12,gp53:aiiA phage were significantly lower comparatively to PE3Δgp1-gp12 phage, indicating a slightly better antibacterial activity of this chimeric phage. In biofilm infection experiments, no significant differences were found between the PE3Δgp1-gp12 and chimeric phages. To assess the therapeutic potential of the chimeric phages, a G. mellonella infection model was used. The treatment of infected larvae with the PE3Δgp1-gp12,gp53:aiiA phage resulted in higher survival rates for all time points when compared to PE3Δgp1-gp12 phage and the larvae showed a strong indicator of good health. However, this was not observed for the chimeric phage PE3Δgp1-gp12,gp53:pvdQ. In conclusion, this work demonstrated that the yeast-based phage-engineering platform is an efficient tool for the assembly of P. aeruginosa chimeric phages. Contrary to what was expected, only the chimeric phage PE3Δgp1–gp12,gp53:aiiA showed a significantly better antibacterial activity than the PE3Δgp1–gp12 phage both in vitro and in vivo. However, the data obtained here revealed that the assembly of anti-QS phages is possible and based on the information gathered here, new phage constructs could be assembled to reach better activities.