Unravel the role of hypoxia in the tumor microenvironment: a focus on macrophage-cancer cell interplay

Abstract

Cancer is a consequence not only of genetic aberrations but also of other elements of the surrounding hypoxic tumor microenvironment such as extracellular matrix components, fibroblasts, and immune cells, which affect cancer cells, modulating their activities and influencing tumor progression and therapy response. Despite this knowledge, underlying mechanisms governing these interactions are poorly understood, and their understanding can be translated into new or more efficient therapies. Macrophages are one of the most abundant cells in the tumor microenvironment and depending of the stimuli that they are subjected to, can either present a pro-inflammatory (M1) or anti-inflammatory (M2) phenotype. Although hypoxia and macrophages are independently associated with tumor progression, and macrophages are preferentially recruited to low oxygen areas, there is insufficient information about the influence of hypoxia on macrophage-cancer cell crosstalk, and on macrophage-mediated cancer cell invasion. Therefore, in order to understand how hypoxia can influence the crosstalk between tumor cells and macrophages a co-culture system with cancer cells and human macrophages, derived from healthy blood donors was established. Macrophages were cultured in monoculture or in indirect co-culture with CRC cell line (RKO) in normoxia (20% O2) or hypoxia (1% O2), enabling the collection of biological material to characterize both populations. Firstly, our experimental setup was validated regarding the response of cancer cells and macrophages to hypoxia. Our results suggest that hypoxia triggers a more pro-inflammatory phenotype on macrophages, along with alterations in macrophages function hallmarks: phagocytosis, antigen presenting capacities, and immune response regulation. Hypoxia and co cultures modulate macrophage expression of SIRP1α, CD47, MHC-II, and PD-L1. In addition, the characterization of RKO cells was also evaluated and revealed that hypoxia potentiates invasion, expression of EMT genes and expression of proteolytic genes. Our results demonstrate that hypoxia is a critical feature to have in consideration when studying the tumor microenvironment interactions.

O cancro não resulta apenas de um conjunto de aberrações genéticas, mas também de outros elementos do microambiente tumoral hipóxico, como componentes da matriz extracelular, fibroblastos e células imunes, que afetam as células tumorais, modificando as suas atividades, e influenciando a progressão tumoral e a resposta terapêutica. Apesar de sabermos o impacto que os elementos deste microambiente têm na progressão tumoral, os mecanismos subjacentes que dirigem essas interações são pouco compreendidos, e a sua perceção pode ser traduzida em novas ou mais eficientes terapias. Os macrófagos são uma das células mais abundantes no microambiente tumoral e, dependendo do estímulo a que estão sujeitos, podem ser classificados em pró-inflamatórios (M1) ou anti-inflamatórios (M2). Apesar da hipoxia e dos macrófagos estarem independentemente associados à progressão tumoral, e de os macrófagos serem preferencialmente recrutados para áreas tecidulares com baixos níveis de oxigénio, não há informação suficiente sobre a influência da hipoxia na interação entre macrófagos-células tumorais e na invasão de células tumorais mediada por macrófagos. Portanto, para compreender como a hipoxia pode influenciar a interação entre macrófagos e células tumorais, foi estabelecido um sistema de co-cultura com células tumorais e macrófagos, obtidos através de doadores de sangue saudáveis. Os macrófagos foram mantidos em monocultura e em co-cultura indireta com uma linha celular de cancro colorretal (RKO) em normoxia (20% O2) ou hipoxia (1% O2), permitindo a recolha de material biológico para caracterizar ambas as populações. Em primeiro lugar, a nossa experiência foi validada quanto à expressão de marcadores de hipoxia nos macrófagos e nas células tumorais. Os nossos resultados sugerem que a hipoxia desencadeia um fenótipo mais pró-inflamatório nos macrófagos, concomitantemente com alterações na sua função como: fagocitose, capacidade de apresentação de antigénios e regulação da resposta imune. A hipoxia e as co-culturas revelaram um impacto na expressão nos macrófagos de SIRP1α, CD47, MHC-II e PD-L1. Além disso, a caracterização das células tumorais RKO revelou que a hipoxia potencia invasão, expressão de genes envolvidos na transição epitelial para mesenquimal e expressão de genes com atividade proteolítica. Unravel the role of hypoxia in the tumor microenvironment: a focus on macrophage-cancer cell interplay | vii Os nossos resultados demonstram que a hipoxia é uma característica importante a ser considerada no estudo das interações do microambiente tumoral.