Molecular therapies for bone regeneration: the role of non-coding RNAs in mesenchymal stem/stromal cells

Abstract

Osteoporosis is a chronic skeletal disorder characterized by loss of bone mass and deterioration of the bone tissue, which leads to an increased risk of fractures. The aetiology of this disease resides on the impairment between bone resorption (conducted by osteoclasts) and formation (conducted by osteoblasts). Considering an ageing population, it is expected a steady rising number of cases over the next years, turning osteoporosis into a serious public health issue that represents a leading cause of morbidity and mortality, mainly due to the fragility fractures. Nowadays, the osteoporosis treatments consist predominantly in anti-resorptive drugs that inhibit/prevent bone resorption but are often associated with several side effects. Therefore, the need for new approaches to promote bone homeostasis and regeneration/repair of fragility fractures in patients with osteoporosis is increasing. Over the past years microRNAs (miRNAs), a class of small non-coding RNAs that coordinate virtually all cellular mechanisms through regulation of gene expression, have gained status as important post-transcriptional regulators. Recent studies revealed their pivotal role in the pathogenesis of several human diseases, including osteoporosis. In this context and following the previous results of a microRNA microarray, the main aim of this study was to investigate the role of miR-99a-5p in osteogenic differentiation and evaluate its expression during osteoclastogenesis, crucial processes required for bone formation and repair. Also, we aimed to determine its expression in fracture healing/repair process and fragility fracture samples. To achieve our aims, we first assessed miR-99a-5p expression profile during osteogenic differentiation in both MC3T3 cell line and primary human Mesenchymal Stem/Stromal Cells by reverse transcription – real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). Next, to analyze the biological effect of miR-99a-5p in osteogenesis and proliferation, we performed in vitro transfections of miR-99a-5p mimics and inhibitors. In an attempt to identify relevant mechanisms and pathways of action of miR-99a-5p we further analyzed the protein expression profile of anti-miR-99a-5p transfected cells compared to control. Furthermore, the expression profile of miR-99a-5p during osteoclastogenesis of RAW 264.7 cell line and human monocytes was investigated, as well as the effect of conditioned media from MC3T3 transfected cells on osteoclastogenesis. Finally, miR-99a-5p expression during the bone repair/regeneration process and in patients that suffered an osteoporotic fracture was determined. The results showed that miR-99a-5p was significantly down-regulated during MC3T3 osteogenic differentiation and during early stages of human primary MSC osteogenic differentiation. miR-99a-5p overexpression in pre-osteoblastic cell line MC3T3 led to a decrease of osteogenic differentiation markers, whereas its inhibition enhanced osteogenesis markers, including alkaline phosphatase expression and staining. However, modulation of miR-99a-5p levels in MC3T3 cells did not show to affect proliferation. Proteomic analysis on anti-miR-99a-5p transfected cells showed that numerous proteins known to be involved in osteogenic differentiation were altered, in comparison with the control, such as plexin-A2 (PLXA2), all-trans retinoic acid-induced differentiation factor (ARAID), ARF GTPase-activating protein GIT (GIT1) and Ephrin type-A receptor 2 (EPHA2). Furthermore, inhibition of miR-99a-5p levels were predicted to impact several pathways associated with osteoporosis, including Ephrin receptor, Pl3K-Akt and canonical Wnt pathways. In contrast to osteogenesis, miR-99a-5p was upregulated during osteoclastogenesis from both RAW 264.7 cells and primary human monocytes. We also demonstrated that inhibition of miR-99a-5p in MC3T3 increased the OPG / RANKL mRNA expression ratio and that the supernatant collected from these cells inhibited RAW 264.7 differentiation into osteoclasts. Additionally, results show that miR-99a-5p was differently expressed in a time-dependent manner in the bone marrow of rats upon a bone critical defect injury. Finally, results from bone osteoporotic human samples showed increased miR-99a-5p expression levels compared with osteoarthritis samples. Taken together, our data shows that miR-99a-5p is a critical regulator of osteogenic differentiation and suggest that modulation miR-99a-5p levels might be a strategy to re-establish bone homeostasis in fragile bones.

Osteoporose é uma doença crónica do esqueleto caracterizada pela perda de massa óssea e deterioração do tecido ósseo, que conduz a um aumento do risco da ocorrência de fraturas. A etiologia desta doença reside na desregulação entre a reabsorção (realizada pelos osteoclastos) e a formação (realizada pelos osteoblastos) óssea. Considerando o envelhecimento da população, espera-se um aumento do número de casos nos próximos anos, o que torna a osteoporose um grave problema de saúde pública e uma das principais causas de morbidade e mortalidade, principalmente devido às fraturas de fragilidade às quais estão frequentemente associadas. Atualmente, os tratamentos para a osteoporose consistem predominantemente em drogas que inibem / previnem a reabsorção óssea, mas podem ter vários efeitos secundários associados. Portanto, a necessidade de novas abordagens que promovam a homeostasia do osso e a regeneração de fraturas em pacientes diagnosticados com osteoporose está a aumentar. Nos últimos anos, os microRNAs (miRNAs), uma classe de pequenos RNAs que não codificam proteína e que são importantes reguladores da expressão génica, estão a ganhar cada vez mais relevância como reguladores de mecanismos celulares. Estudos recentes têm vindo a revelar o seu papel na patogénese de várias doenças, entre as quais a osteoporose. Neste contexto, o principal objetivo deste estudo foi investigar o papel do miR-99a-5p na diferenciação osteogénica, um processo necessário e indispensável para a formação e regeneração óssea. Além disso, explorou-se o perfil de expressão deste microRNA na osteoclastogénese, durante a regeneração de fraturas ósseas e em pacientes com osteoporose. Para atingir estes objetivos, começamos por avaliar o perfil de expressão do miR-99a-5p durante a diferenciação osteogénica, tanto na linhagem celular MC3T3, como em células mesenquimais do estroma humanas (MSC), por transcrição reversa - reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR). Em seguida, para analisar o efeito biológico do miR-99a-5p na osteogénese e na proliferação, foram realizadas transfeções in vitro de oligonucleótidos que mimetizam ou inibem o efeito do miR-99a-5p. Com intuito de identificar quais os alvos e vias moleculares afetadas e controladas pelo miR-99a-5p, investigámos o perfil de proteínas expressas pelas células transfetadas com anti-miR-99a-5p em comparação com o controlo. Para além disso, o perfil de expressão do miR-99a-5p foi também estudado durante a osteoclastogénese da linha celular RAW 264.7 e de monócitos humanos, bem como o efeito do meio condicionado das células MC3T3 transfetadas na osteoclastogénese. Por fim, determinou-se a expressão do miR-99a-5p durante o processo de regeneração óssea num modelo animal e em pacientes que sofreram fraturas de fragilidade/osteoporóticas. Os resultados obtidos demostraram que o miR-99a-5p é significativamente subexpresso durante a diferenciação osteogénica das MC3T3 e durante as fases iniciais da diferenciação osteogénica das MSCs humanas. A sobreexpressão do miR-99a-5p na linha celular pré-osteoblástica MC3T3 resultou numa diminuição dos marcadores de diferenciação osteogénica enquanto que a sua inibição aumentou a expressão dos mesmos marcadores osteogénicos, entre os quais da fosfatase alcalina. Verificou-se ainda que a modulação dos níveis do miR-99a-5p na linhagem celular MC3T3 não afetou a proliferação celular. A análise proteómica dos lisados celulares provenientes das MC3T3 em que a expressão do miR-99a-5p foi inibida, comparativamente ao controlo, mostrou que diversas proteínas, conhecidas por estarem envolvidas na diferenciação osteogénica, se encontravam alteradas, como a plexin-A2 (PLXA2), all-trans retinoic acid-induced differentiation factor (ARAID), ARF GTPase-activating protein GIT (GIT1) and Ephrin type-A receptor 2 (EPHA2). Os resultados mostraram também que a inibição dos níveis do miR-99a-5p influenciam várias vias descritas como estando associadas à osteoporose, incluindo a Ephrin receptor, Pl3K-Akt e canonical Wnt. Em contraste com o perfil de expressão verificado durante a osteogénese, o miR-99a-5p encontra-se sobreexpresso ao longo da osteoclastogénese das RAW 264.7 e dos monócitos humanos. Demonstrámos também que a inibição do miR-99a-5p nas MC3T3 fomentou o aumento de expressão da razão OPG/RANKL ao nível do mRNA e que o sobrenadante recolhido a partir dessas células inibe a diferenciação das RAW 264.7 em osteoclastos. Adicionalmente, os resultados mostram que a expressão do miR-99a-5p varia ao longo do tempo na medula óssea de ratos após uma lesão óssea de defeito crítico. Finalmente, os resultados obtidos a partir de amostras humanas de pacientes com fractura de fragilidade e diagnosticados com osteoporose mostraram que estes apresentam níveis mais elevados de expressão do miR-99a-5p comparativamente ao controlo (amostras de pacientes com osteoartrite). Tendo em conta os resultados obtidos ao longo deste trabalho, concluímos que o miR-99a-5p é um regulador crítico da diferenciação osteogénica. No futuro, a modulação dos níveis do miR-99a-5p no osso pode ser utilizada como uma estratégia que tem como objetivo restabelecer a homeostase óssea.