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https://hdl.handle.net/1822/44771
Título: | Construction and validation of Escherichia coli mutants to improve the curcumin production by an engineered strain |
Outro(s) título(s): | Construção e validação de mutantes de Escherichia coli para aumentar a produção de curcumina por uma estirpe geneticamente modificada |
Autor(es): | Couto, Márcia Regina Linhares |
Orientador(es): | Rodrigues, Lígia M. Rodrigues, Joana Lúcia Lima Correia |
Palavras-chave: | Curcumin production Genetic engineering E. coli mutants Gene deletion CRISPR-Cas9 system Produção de curcumina Engenharia genética Mutantes de E. coli Deleção de genes Sistema CRISPR-Cas9 |
Data: | 2016 |
Resumo(s): | Curcumin has been reported for its beneficial therapeutic properties including as anti-cancer agent.
However, it has poor bioavailability and it is quickly metabolized in the human body, implying a
repetitive oral administration if a therapeutic effect is envisaged. Besides, its extraction from plants is
very expensive. For these reasons, the use of microorganisms to produce it on large scale and with
greater yields constitutes an interesting alternative. With this aim, Escherichia coli K-12 MG1655 (DE3)
was previously engineered with three enzymatic steps (4-coumarate-CoA ligase, diketide-CoA synthase
and curcumin synthase 1) that catalyze the production of curcumin from ferulic acid. In the present
study, the optimal strain, operational conditions and media composition for the production of curcumin
by E. coli harboring the artificial biosynthetic pathway were established. Previously, a standard two-step
fermentation strategy (LB+M9 minimal medium) was used. Although feasible at the laboratory scale,
the biomass separation is much more difficult, laborious and expensive in large-scale fermentations.
Therefore, herein a single medium formulation more suitable for the production of curcumin at an
industrial set-up was implemented. MOPS minimal medium, TB and LB were evaluated. Using the
optimized conditions, the curcumin concentration obtained in this study was the highest reported to be
produced by a heterologous organism, 686.7±59.7 µM in TB (43 h) and 822.6±28.1 µM in LB+M9
(63 h). These results were obtained using E. coli BL21 (DE3) that was identified as the best producer
since it produced 3.7 times more curcumin than E. coli K-12 MG1655 (DE3). Moreover, curcumin
toxicity against E. coli cells was evaluated. The tests performed showed that curcumin concentrations
above 400 µM influence negatively the E. coli cells growth. Furthermore, one of the purposes of the
current work was to construct and validate several E. coli mutants (e.g. ΔfumA,fumB,fumC) previously
identified by an in silico approach as the most promising towards an increased production of curcumin
from ferulic acid. The deletion of fumB gene from E. coli K-12 MG1655 (DE3) genome was
accomplished and it resulted in a faster curcumin production in the initial 21 h, but after 63 h, the
curcumin production by this mutant was 2.6 times lower as compared to the ‘original’ strain (i.e. the
strain harboring the curcuminoids biosynthetic pathway but with no gene knockout). The same deletion
in E. coli BL21 (DE3) genome resulted in a more significant decrease in curcumin production. In the
future, the triple knock-out (ΔfumA,fumB,fumC) should be constructed to evaluate if curcumin
production can indeed be improved as predicted in silico. A curcumina tem sido reportada pelas suas propriedades benéficas incluindo como agente anticancerígeno. Apesar da curcumina apresentar um alto potencial terapêutico, tem uma baixa biodisponibilidade e é rapidamente metabolizada no organismo humano, o que implica uma repetitiva administração oral para atingir o efeito terapêutico pretendido. Além disso, a sua extração a partir das plantas é muito dispendiosa. Por estas razões, o uso de microrganismos para a produzir em larga escala e com melhores rendimentos constitui uma alternativa atraente. Neste sentido, Escherichia coli K-12 MG1655 (DE3) foi previamente geneticamente modificada adicionando três reações enzimáticas (4-cumarato-CoA ligase, dicetídeo-CoA sintase e curcumina sintase 1) que catalisam a produção de curcumina a partir do ácido ferúlico. No presente trabalho foi estabelecida a estirpe, as condições operacionais e a composição de meio ótimas para a produção de curcumina por E. coli contendo a via biossintética artificial. Anteriormente, utilizou-se uma estratégia comum de dois passos (LB+meio mínimo M9). Apesar de ser praticável numa escala laboratorial, a separação de biomassa é muito mais difícil, trabalhosa e dispendiosa numa fermentação em grande escala. Assim, foi implementada uma única formulação de meio mais adequada para a produção de curcumina a nível industrial. O meio mínimo MOPS, TB e LB foram avaliados. Usando as condições otimizadas, a concentração de curcumina produzida neste estudo foi mais elevada do que as previamente descritas na literatura, 686,7±59,7 µM em TB (43 h) e 822,6±28,1 µM em LB+M9 (63 h). Estes resultados foram obtidos usando a estirpe E. coli BL21 (DE3) que foi a identificada como melhor produtora após produzir 3,7 vezes mais curcumina do que a E. coli K-12 MG1655 (DE3). Além disso, a toxicidade da curcumina para células de E. coli foi avaliada. Os resultados mostraram que concentrações de curcumina acima de 400 µM influenciam negativamente o crescimento de E. coli. Adicionalmente, um dos objetivos do presente trabalho foi construir e validar vários mutantes de E. coli (p. ex., ΔfumA,fumB,fumC) que foram previamente identificados in silico como os mais promissores no sentido de aumentar a produção de curcumina a partir do ácido ferúlico. A deleção do gene fumB do genoma de E. coli K-12 MG1655 (DE3) foi efetuada e resultou numa produção mais rápida de curcumina nas 21 h iniciais, mas após 63 h, a produção de curcumina usando este mutante foi 2,6 vezes mais baixa do que a da estirpe que lhe deu origem. A mesma deleção no genoma de E. coli BL21 (DE3) resultou num decréscimo ainda mais significativo na produção de curcumina. No futuro, é necessário ainda construir o mutante triplo (ΔfumA,fumB,fumC) para avaliar se a produção de curcumina é efetivamente aumentada como previsto in silico. |
Tipo: | Dissertação de mestrado |
Descrição: | Dissertação de mestrado em Bioengenharia |
URI: | https://hdl.handle.net/1822/44771 |
Acesso: | Acesso aberto |
Aparece nas coleções: | BUM - Dissertações de Mestrado |
Ficheiros deste registo:
Ficheiro | Descrição | Tamanho | Formato | |
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Márcia Regina Linhares Couto.pdf | Dissertação de Mestrado | 2,59 MB | Adobe PDF | Ver/Abrir |