Avaliação do potencial antimicrobiano da endolisina PlyPl23 derivada de um Bacteriófago de Paenibacillus larvae para o controlo da Loque Americana

Abstract

A Loque Americana (LA) é uma doença causada pela Paenibacillus larvae, uma bactéria gram-positiva formadora de esporos, que são a forma infetante das primeiras fases larvares das abelhas. Esta doença leva à destruição de colónias inteiras, causando graves perdas financeiras e da população de abelhas, em todo mundo. A restrição à presença de antibióticos no mel imposta pela legislação Europeia, e o aparecimento de resistências aos antibióticos mais usados, dificulta o seu uso no tratamento da LA, tornando urgente desenvolver métodos antimicrobianos alternativos. O uso de endolisinas tem sido considerado uma boa alternativa aos antibióticos, especialmente em bactérias gram-positivas. Neste trabalho avaliou-se o efeito antimicrobiano da endolisina PlyPl23, uma N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase derivada do fago phiIBB_Pl23, no controlo de P. larvae. Após clonagem, expressão e purificação da PlyPl23, realizaram-se ensaios in vitro de modo a determinar as condições de reação ótimas e avaliar a sua capacidade antimicrobiana. Todas as estirpes identificadas como P. larvae (71.2 % pertencentes ao genótipo ERIC I e 19 % ao ERIC II) foram sensíveis à PlyPl23 com um maior espetro de ação do que o fago phiIBB_Pl23 (76.2 %). A PlyPl23 apresentou valores de pH ótimo a pH 3 e muito elevado a pH 4 (em média, 56.5 % da atividade apresentada em pH3), que correspondem a níveis de pH encontrados no mel, néctar, pólen e geleia real. Quando suplementada com 200 mM NaCl a pH 7 (pH semelhante ao das larvas, 6.8), apresentou resultados de atividade mais elevados do que sem a adição do sal, (em média, com 0 mM NaCl observou-se 74.6 % da atividade obtida com 200 mM NaCl). Ao contrário, a adição do ião Zn2+ ao tampão de reação não melhorou a atividade. Relativamente à avaliação do efeito antimicrobiano da PlyPl23, verificou-se que uma concentração de 0.2 μM foi suficiente para diminuir a população de P. larvae em cerca de 4 log. Partindo de 104 CFU.ml-1, que se assemelha às concentrações de P. larvae encontradas em larvas infetadas, a enzima reduziu a bactéria para níveis não detetáveis. No que diz respeito aos testes de estabilidade em substâncias importantes a ter em conta para a aplicação in vivo, a enzima, manteve a atividade quando sujeita ao contato com, sacarose, e melhorou o seu efeito antibacteriano após contato com geleia real (aumento médio de 64.9 % de atividade após 30 min) e com homogeneizado de larva (diminuição mais 1 log de atividade após 15 min), relativamente à ação em tampão Tris pH7, 200 mM NaCl. A PlyPl23 é, até à data, a primeira endolisina derivada de um fago de P. larvae a ser reportada, e os resultados obtidos revelaram um elevado potencial para integrar um produto comercial para o controlo da loque americana.

The American foulbrood (AFB) is a disease caused by Paenibacillus larvae, a gram-positive spore-forming bacteria. The spores are the infective form, of the first larval stages of honeybees. This disease leads to the destruction of entire colonies, causing serious financial losses and the decline in bee population worldwide. The restriction on the presence of antibiotics in honey imposed by European legislation, and the emergence of bacterial resistance to commonly used antibiotics, hamper its use in the AFB treatment and makes urgent the development of alternative antimicrobial methods. The use of endolysins, bacteriophage-derived enzymes, has been considered a good alternative to antibiotics, particularly in gram-positive bacteria. In this work, the antimicrobial effect of an endolysin, PlyPl23, to control P. larvae was evaluated. PlyPl23, was identified as an N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase and derived from phage phiIBB_Pl23. After cloning, expression and purification of the enzyme, in vitro assays were performed to determine the optimal reaction conditions and to evaluate the antimicrobial performance. All the strains identified as P. larvae (71.2 % belonging to genotype ERICI and 19 % to ERIC II) were sensitive to PlyPl23 with a broader spectrum of action than phiIBB_Pl23 phage (76.2 %). PlyPl23 presented the optimum pH at pH 3 and very high activity at pH 4 (56.5 % of the activity observed in pH 3, on average), which correspond to the pH levels found in honey, nectar, pollen and royal jelly. When PlyPl23 acted in Tris pH 7 supplemented with 200 mM NaCl (pH similar to larvae, 6.8), results showed higher activity than without the addition of salt, (on average, with 0 mM NaCl was observed 74.6% of the activity obtained with 200 mM NaCl). In contrast, the addition of Zn2+ to the reaction buffer did not improve the activity. Relatively to the antimicrobial effect of PlyPl23, it was found that a concentration of 0.2 μM was sufficient to decrease the population of P. larvae in about 4 log. Starting from a concentration of 104 CFU.ml-1, which is similar to concentrations found in infected larvae, the enzyme reduced the bacteria to non-detectable levels. Concerning to stability tests when the enzyme was in contact with substances that are important to consider for in vivo applications, it was observed that the enzyme remained active after contact with sucrose, and improved its antibacterial effects when in contact with royal jelly (average increase of 64.9% activity after 60 min) and larvae homogenized (decrease of 1 log of activity after 15 min), comparing with the action in Tris pH 7, 200 mM NaCl. PlyPl23 is, to this date, the first P. larvae phage- derived endolysin that was reported, and the results revealed a high potential of the enzyme to comprise a commercial product for the control of AFB.