Estudo de diferentes sistemas de produção e purificação de frutalina recombinante com vista à sua aplicação biomédica

Abstract

A frutalina é a principal lectina de sementes da fruta-pão (Artocarpus incisa). Esta lectina é uma glicoproteína tetramérica, parcialmente glicosilada e pertencente à sub-família das lectinas relacionadas com a jacalina com afinidade de ligação a resíduos de D-galactose. Em estudos anteriores a frutalina recombinante produzida em Pichia pastoris e purificada por cromatografia de exclusão molecular (SEC) mostrou ter um potente efeito citotóxico em células do cancro do cólon do útero (HeLa) e do adenocarcinoma do cólon (HCT 116), sendo este efeito devido à indução de morte celular por apoptose por uma via dependente das caspases e independente da p53. No entanto a purificação por SEC limita a aplicação da frutalina recombinante uma vez que é um processo demorado e resulta em amostras muito diluídas, pelo que metodologias alternativas à sua purificação são necessárias. Por outro lado, a Escherichia coli, como sistema de expressão, permite um processo de produção e purificação mais eficiente contudo as versões resultantes não têm efeito citotóxico. Assim, com o presente trabalho pretendeu-se avaliar o efeito citotóxico de versões de frutalina recombinante produzidas em E. coli, bem como de versões produzidas em P. pastoris e purificadas por diferentes metodologias, nomeadamente cromatografia de exclusão molecular (SEC), cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) e cromatografia de afinidade ao níquel (IMAC-Ni). Para atingir este objetivo foram testadas duas versões de frutalina produzidas em E. coli, uma delas contendo o tag His6 (EcrHis6FTL) e outra resultante da clivagem do Fh8 da versão EcrFh8FTL (EcrCFTL), em linhas tumorais humanas com (HCT 116 p53+/+) e sem a forma nativa da p53 (HCT 116 p53-/-), e nenhuma destas versões mostrou ter efeito anti-proliferativo em ambas as linhas tumorais. O que sugere que a glicosilação assume um papel importante na atividade da frutalina e a ausência desta resulta na inexistência de atividade anti-proliferativa. Por outro lado, foram produzidas versões de frutalina em P. pastoris, versões glicosiladas, e usadas 3 metodologias de purificação distintas, SEC, HIC e IMAC-Ni. A purificação por HIC e IMAC-Ni não se revelou eficiente contrariamente à purificação por SEC. A frutalina purificada por SEC é estável estruturalmente e mantém a sua atividade anti-proliferativa na linha HCT 116 p53+/+ mesmo após 6 meses de armazenamento a -20ºC, contudo de entre todas as versões testadas esta foi a que mostrou ter um menor efeito citotóxico. A metodologia HIC resultou em 2 amostras diferentes, uma delas enriquecida na fração glicosilada e outra desfavorecida nesta fração, sendo que a primeira possui cerca do dobro da potência da segunda, contudo estas diferenças não são estatisticamente significativas. Em relação à PprFTLHis6 produzida em P. pastoris e purificada por IMAC-Ni, clonada pela primeira vez neste trabalho de modo a facilitar o processo de purificação, verificou-se que o tag His6 não influencia negativamente a atividade anti-proliferativa da frutalina e esta possui um potente efeito anti-proliferativo na linha HCT 116 p53+/+. Curiosamente, as amostras resultantes da metodologia de purificação mais eficiente (SEC) mostraram ter menor efeito anti-proliferativo comparativamente com as amostras resultantes das metodologias menos eficientes (HIC e IMAC-Ni) onde foram obtidas amostras de frutalina recombinante com um potente efeito anti-proliferativo em linhas tumorais humanas HCT 116 p53+/+.

Frutalin is the major lectin of breadfruit seeds (Artocarpus incisa). It is a tetrameric glycoprotein, partially glycosylated, which belongs to the lectins sub-family related to jacalin, with affinity to bind to D-galactose residues. In previous studies, frutalin produced in Pichia pastoris and purified by size exclusion chromatography (SEC) was found to have a potent cytotoxic effect in cervical cancer cells (HeLa) and colon adenocarcinoma (HCT 116). This effect results of apoptotic cell death by caspase-dependent and p53 independent pathways. However, the purification by SEC restricts the application of recombinant frutalin, since it is a lengthy process and results in very dilute samples, leading to an increasing necessity for alternative methods. By contrast, the use of Escherichia coli as an expression system allows a more efficient production and purification process. However, the resulting versions had no cytotoxic effect. Thus, the present work aims to evaluate the cytotoxic effects of recombinant versions of frutalin produced in E. coli, as well as the versions produced in P. pastoris and purified by different methods, namely by size exclusion chromatography (SEC), hydrophobic interaction chromatography (HIC) and nickel affinity chromatography (IMAC-Ni). To achieve this goal, two versions of frutalin produced by E. coli , one containing the His6 tag (EcrHis6FTL) and the other resulting from the cleavage of the Fh8 from the EcrFh8FTL version (EcrCFTL), were tested in human tumor lines with the wild-type p53 form (HCT 116 p53+/+) and without p53 (HCT 116 p53-/-). The results obtained showed that none of the versions had an antiproliferative effect in both tumor lines, suggesting that glycosylation may play an important role in frutalin activity and that its absence does not result in an anti-proliferative activity. Moreover, frutalin versions were produced in P. pastoris, glycosylated versions, and three distinct purification methodologies were used, namely SEC, HIC and IMAC-Ni. Purification by HIC and IMAC-Ni was not efficient, oppositely to purification by SEC. The frutalin purified by SEC is structurally stable and retains its anti-proliferative activity in line HCT 116 p53+/+ even after 6 months of storage at -20°C. However, among the tested versions, the latter showed to have the lower cytotoxic effect. The HIC methodology resulted in two different samples, one enriched in the glycosylated fraction and the other weakened in this fraction. Specifically, the first sample had nearly double the power of the second one, despite these differences not being statistically significant. Regarding the PprFTLHis6 produced in P. pastoris and purified by IMAC-Ni, cloned for the first time in this study to facilitate the purification process, it was found that the His6 tag did not inhibit the anti-proliferative activity of this frutalin and that it had a potent anti-proliferative effect on HCT 116 p53+/+ cell line. Interestingly, samples resulting from the most efficient purification method (SEC) exhibited less anti-proliferative effect when compared with the samples resulting from less efficient methodologies (HIC and IMAC-Ni), which resulted in recombinant versions of frutalin with a potent anti-proliferative effect on HCT 116 p53+/+ cell line.