Use of biocides and surfactants to control Pseudomonas fluorescens biofilms : role of the hydrodynamic conditions

Abstract

Biofilms constitute a protected growth modality that allows the bacteria to survive in hostile environments. The most common practice to eliminate unwanted biofilms is the application of antimicrobial agents. However, current disinfection practices show often inefficacy in the control of biofilms. The main goals of this work were the development of effective strategies, based on the application of chemical agents, in order to control biofilms formed by Pseudomonas fluorescens, and the evaluation of the impact of the hydrodynamic conditions under which biofilms were formed, in the phenotypic characteristics of the biofilms, as well as, in their susceptibility to antimicrobial agents. The antimicrobial agents tested were two non-oxidizing aldehyde-based biocides (ortho-phthalaldehyde - OPA and glutaraldehyde - GTA), two oxidizing biocides (sodium hydroxide - NaOH and sodium hypochlorite - SHC) and two surfactants (cetyltrimethyl ammonium bromide - CTAB and sodium dodecyl sulfate - SDS). The antimicrobial agents were selected due to their emergent and practical application in several industrial areas. The bacterial biofilms were developed on stainless steel surfaces in a flow cell reactor and in a bioreactor with a rotating device, being implemented different hydrodynamic conditions (laminar and turbulent flow) for biofilm formation. The action of the antimicrobial agents was assessed, mainly, by the determination of the biofilm respiratory activity, as well as, by the quantification of the biofilm mass removed, being tested several concentrations, contact times and strategies of application. The bacteria grown in biofilms under different flow regimes were phenotypically characterized in terms of outer membrane proteins expression (OMP), metabolic activity, biochemical composition and structure, being their phenotypes compared with bacteria in planktonic state. The respirometric method based on the assessment of the bacterial respiratory activity, the basic tool in the evaluation of the efficiency of the antimicrobial agents and in the characterization of the metabolic state of the bacteria, was validated by comparison with two reference methods (assessment of viability by “Live/Dead” stains and culturability in a solid medium). Within the scope of this thesis, and for further comparison, it was assessed the antimicrobial properties of the biocides OPA and GTA and of the surfactants CTAB and SDS in the control of planktonic cells. These experiments revealed that, in the range of concentrations tested, OPA was more efficient in the bacterial respiratory inactivation than GTA, causing total bacterial inactivation. Concerning the surfactants, both caused reduction of the bacterial activity, but only CTAB caused total bacterial inactivation. However, the chemical agents reacted differently with the bacteria, being CTAB the unique that promoted cellular disruption. The bacterial phenotype was affected with the application of the chemical agents, since the OMP expression and the cellular pellet colour changed after chemical treatment. The presence of bovine serum albumin (BSA) in the bacterial cultures (in order to simulate dirty conditions found in industrial systems) reduced significantly the antimicrobial action of the several chemical agents. Concerning biofilm formation in the flow cells, it was found that the flow regime and the sessile mode of life itself caused significant modifications in the metabolism, morphology and constitutive biochemical composition of the P. fluorescens cells. The application of biocides (OPA and GTA) and surfactants (CTAB and SDS) to the biofilms developed in the flow cells, under different hydrodynamic conditions, revealed that, independently of the concentration, exposure time and strategy of application, every chemical agent was more effective in the inactivation of laminar biofilms than turbulent biofilms, being OPA the only chemical that caused total inactivation. The entire chemicals tested exhibited poor ability in the removal of biofilms from the surfaces, independently of the flow regime under which biofilms were formed. It was verified a post-antimicrobial agents application effect for both biofilms, since after chemical treatment, biofilms recovered with the time their metabolic activity and viability, an evidence of the capability of biofilms to regrow. The comparison of these results with the ones obtained with the planktonic cells emphasises the higher resistance of biofilm microorganisms to disinfection when compared with their freely suspended counterparts. The results also underscore the inadequacy of planktonic testing methods for evaluating antimicrobial agents to be used as a means to control biofilms. This fact contradicts the presuppositions of the European Standard – EN 1276 (1997), where the bactericidal activity of disinfectants to be used in food, industrial, domestic and institutional areas are tested using cells in planktonic state. The biofilms grown in the bioreactor with the rotating device showed an accentuated inherent mechanical stability, i.e., a strong cohesion face to sudden changes in the surrounding hydrodynamic conditions. These biofilms were treated with OPA, GTA, NaOH, SHC, CTAB and SDS with the purpose to ascertain if after chemical treatment the mechanical stability of the biofilms (the biofilm behaviour face to external mechanical stress) was changed. It was found that biofilms previously treated with CTAB, NaOH, SHC, OPA and SDS (for concentrations near the critical micellar concentration) the biofilm mechanical stability decreased. Concerning GTA and SDS (for low concentrations), it was found an increase in the biofilm mechanical stability. These results highlight that even the synergistic chemical and mechanical treatments did not induce total biofilm eradication. Finally, with the purpose to ascertain if a strain can represent a specie, the biofilm formation ability, as single or mixed populations, of two P. fluorescens native strains from a dairy industry was assessed using the flow cell reactor and the bioreactor rotating system. Similar characteristics were found comparing the biofilms formed by the different strains, as single or mixed biofilms. The phenotypic characteristics of the native strains were comparable with the ones obtained with the type strain, even when native strains were used to form mixed biofilms. The results collected in this work allowed to conclude the role of the flow regime under which biofilms are formed in their susceptibility to antimicrobial agents, as well as, in the success/fallibility of procedures for biofilm control, fundamentally when extreme conditions are tested. The biofilms recovered their metabolic activity and viability, after chemical treatment, even when they presented merely residual activity. The submission of biofilms, previously exposed to antimicrobial agents, to hydrodynamic conditions different from the ones biofilms were developed did not cause total biofilm eradication from the surfaces contributing, therefore, for biofilm recalcitrance.

Os biofilmes constituem uma forma de crescimento que permite a sobrevivência de bactérias em condições ambientais adversas. Os procedimentos mais comuns de controlo de biofilmes indesejáveis englobam a aplicação de agentes antimicrobianos. Contudo, esses procedimentos de desinfecção demonstram, frequentemente, alguma ineficiência na inactivação e eliminação dos biofilmes. Este trabalho teve como principais objectivos o desenvolvimento de estratégias eficientes de controlo de biofilmes formados por Pseudomonas fluorescens recorrendo a produtos químicos antimicrobianos, e a avaliação do impacto das condições hidrodinâmicas usadas durante a formação de biofilme, nas suas características fenotípicas, bem como na sua sensibilidade aos agentes antimicrobianos. Os agentes antimicrobianos testados incluiram dois biocidas não-oxidantes da família dos aldeídos (OPA e GTA), dois biocidas oxidantes (NaOH e SHC) e dois tensioactivos (CTAB e SDS), todos representando aplicações práticas e emergentes em vários sectores industriais. Os biofilmes bacterianos foram desenvolvidos sobre superfícies de aço inoxidável em células de fluxo e num bioreactor com sistemas rotativos, utilizando-se diferentes condições hidrodinâmicas (fluxo turbulento e laminar). O desempenho dos agentes antimicrobianos foi avaliado pela determinação da actividade respiratória dos biofilmes, bem como pela quantificação da massa de biofilme removida, tendo-se testado várias concentrações, tempos de contacto e estratégias de aplicação. As bactérias desenvolvidas em biofilme sob diferentes regimes de fluxo foram caracterizadas fenotipicamente em termos da expressão de proteínas da parede celular (OMP), actividade metabólica, composição bioquímica, e estrutura, e foram comparadas com as bactérias em suspensão. O método respirométrico baseado na determinação da actividade respiratória das bactérias, ferramenta básica na determinação da eficiência dos agentes antimicrobianos e na caracterização do estado metabólico das bactérias, foi validado pela comparação com dois métodos de referência (determinação da viabilidade recorrendo a corantes “Live/Dead” e caracterização da cultivabilidade em meio sólido). No âmbito da dissertação, e para comparação posterior, começou-se por avaliar a capacidade antimicrobiana dos biocidas GTA e OPA e dos tensioactivos CTAB e SDS no controlo de células em suspensão. Estes ensaios revelaram que, na gama de concentrações testadas, o OPA foi mais eficiente na inactivação respiratória das bactérias do que o GTA, provocando a inactivação total das células bacterianas. Em relação aos tensioactivos, apesar de ambos causarem redução da actividade respiratória, somente o CTAB provocou inactivação total das células. Contudo, os vários agentes químicos reagiram com as bactérias de forma diferente, tendo o CTAB sido o único que provocou ruptura celular. O fenótipo bacteriano foi afectado com a aplicação dos agentes químicos, pois a expressão das OMP e a cor do “pellet” celular sofreram alteração. A presença de BSA (proteína de soro bovino) nas culturas bacterianas em suspensão (como forma de simulação de condições sujas encontradas em ambientes industriais) causou reduções significativas na acção antimicrobiana de todos os agentes químicos testados. Relativamente aos ensaios de formação de biofilmes nas células de fluxo, verificou-se que o regime de fluxo e o próprio modo de vida séssil causaram alterações importantes no metabolismo, morfologia e composição bioquímica constitutiva das bactérias P. fluorescens. Os ensaios de aplicação dos biocidas (GTA e OPA) e dos tensioactivos (CTAB e SDS) aos biofilmes formados nas células de fluxo, em condições hidrodinâmicas diferentes, revelaram que, independentemente da concentração, tempo de exposição e estratégia de aplicação, todos os produtos foram mais eficientes na inactivação de biofilmes formados em regime laminar do que em regime turbulento, sendo o OPA o único químico a causar inactivação total. Todos os agentes químicos testados revelaram ser pouco eficientes na remoção de biofilme das superfícies, independentemente do regime de fluxo em que foram desenvolvidos. Verificou-se um efeito pósaplicação do tratamento químico para ambos os tipos de biofilme, pois os biofilmes recuperaram com o tempo a sua actividade metabólica e a sua viabilidade, prova da capacidade de recrescimento dos biofilmes. A comparação destes resultados com os obtidos com as bactérias em suspensão reforça o fenómeno da maior resistência à desinfecção de microrganismos em biofilmes quando comparados com os mesmos em suspensão. Estes resultados, também, questionam o uso de testes em suspensão para avaliação de agentes antimicrobianos, principalmente, quando estes se destinam ao controlo de biofilmes. Este facto refuta os pressupostos existentes na Norma Europeia – EN 1276 (1997), em que a actividade bactericida de potenciais desinfectantes, para uso nas áreas alimentar, industrial,doméstica e institucional, é investigada com células em estado planctónico. Os biofilmes desenvolvidos no bioreactor de sistema rotativo apresentaram uma acentuada estabilidade mecânica intrínseca, isto é, uma forte coesão face a alterações súbitas das condições hidrodinâmicas do meio circundante. Estes biofilmes quando tratados com GTA, OPA, NaOH, SHC, CTAB e SDS com o objectivo de investigar se após o tratamento químico sofreram alterações da sua estabilidade mecânica (o seu comportamento face a condições externas adversas). Verificou-se que os biofilmes previamente tratados com CTAB, NAOH, SHC, OPA e SDS (para concentrações próximas da concentração miceliar crítica) registaram uma diminuição da sua estabilidade mecânica. Em relação ao GTA e SDS (para concentrações baixas), verificou-se que contribuíam para o aumento da estabilidade mecânica do biofilme. Porém, mesmo a sinergia entre tratamentos químico e mecânico não provocou a erradicação total do biofilme. Com o objectivo de averiguar se o comportamento de uma estirpe poderá representar o da espécie, determinou-se a capacidade de formação de biofilme por duas estirpes de P. fluorescens nativas de uma indústria de lacticínios, usando o reactor de célula de fluxo e o bioreactor de sistema rotativo. Da comparação das características dos biofilmes formados pelas duas estirpes individual e em cultura mista, concluiu-se que estes eram semelhantes. As características fenotípicas das estirpes nativas foram comparáveis às obtidas com a estirpe tipo, independentemente do modo de formação de biofilme (simples e misto). Os resultados coligidos neste trabalho permitiram concluir acerca da importância do regime de fluxo, sob o qual os biofilmes são formados, na susceptibilidade destes aos produtos antimicrobianos, bem como, no sucesso/falibilidade dos procedimentos de controlo de biofilmes usando esses agentes antimicrobianos, fundamentalmente quando condições extremas são testadas. As bactérias desenvolvidas em biofilme, após tratamento com os agentes químicos, demonstraram recuperar, num curto espaço de tempo, a sua actividade metabólica e viabilidade, mesmo quando os biofilmes apresentavam actividade respiratória residual. Esta constatação é indício irrefutável da capacidade de recrescimento dos biofilmes após o interregno da aplicação dos agentes antimicrobianos. A submissão de biofilmes previamente expostos aos agentes antimicrobianos, a condições hidrodinâmicas diferentes das quais foram desenvolvidos não conduziu à erradicação total dos biofilmes das superfícies. Todos os factos anteriores podem conduzir ao aparecimento de biofilmes recalcitrantes.