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https://hdl.handle.net/1822/33045
Título: | Molecular cytopathogenesis induced by the Mycobacterium ulcerans toxin, mycolactone |
Outro(s) título(s): | Citopatogénese molecular induzida pela toxina do Mycobacterium ulcerans, micolactona |
Autor(es): | Gama, José B. |
Orientador(es): | Pedrosa, Jorge Ludovico, Paula |
Data: | Out-2014 |
Resumo(s): | Buruli ulcer (BU) is a tropical neglected, necrotizing skin disease caused by Mycobacterium
ulcerans infection. The tissue damage that characterizes the disease is driven by the lipidic
exotoxin mycolactone, which is known to play a central role in the pathogenesis of BU. However,
the mechanisms by which mycolactone exerts its cytotoxicity are still unknown. Uncovering these
mechanisms could lead to new forms of BU treatment, based on the neutralization of the
mycolactone cytotoxic effects.
The research conducted in the scope of this thesis aimed at increasing our understanding of
the molecular cytopathogenicity of mycolactone, focusing on its potent cytotoxicity. To this end,
two complementary experimental approaches were followed: in vitro studies on L929 mouse
fibroblasts incubated with purified mycolactone and; in vivo studies in an experimental model of
BU disease, the mouse footpad infection with M. ulcerans.
Using two-dimensional gel electrophoresis, we found several regulators and constituents of
both actin- and tubulin-cytoskeleton (Dync1i2, Cfl1, Crmp2, Actg1, Stmn1) altered in
mycolactone-exposed L929 cells, providing new molecular evidences for the impact of
mycolactone upon cytoskeleton, which present conformational disarrangements, as observed by
immunofluorescence. Consistently, our study of autophagy showed that autophagosomelysosome
fusion, a process dependent on microtubule and dynein-driven transport, is inhibited by
mycolactone. In agreement with the impairment of cytoskeleton dynamics and functions in
mycolactone-exposed cells, we found that both cytoskeleton-associated BH3-only proteins (BIM
and BMF) are responsive to the cellular stress induced by mycolactone, being up-regulated in
L929 cells exposed to purified toxin, as well as in mycolactone-producing M. ulcerans-infected
mouse footpads. Importantly, the knockdown of Bim protected L929 cells from mycolactoneinduced
cytotoxicity, demonstrating that the toxin triggers an intrinsic apoptotic pathway mediated
by BIM.
The second larger group of proteins found down-regulated in mycolactone-exposed L929 cells
comprises collagen-modifying enzymes (Plod1, Plod3, P4ha1) essential for the formation and
stabilization of collagen fibers. Consistent with a mycolactone impact upon the collagen fibers
stability, in vivo analyses in the BU mouse model revealed a mycolactone-dependent
degeneration of dermal collagen fibers upon infection with M. ulcerans.VII
Overall, this work provides new insights on the cytotoxic mechanisms of mycolactone, the key
pathogenic factor of M. ulcerans. We propose that mycolactone induces nonfunctional
cytoskeletal alterations, affecting cytoskeleton-dependent functions and, consequently, cellular
homeostasis, triggering a BIM-mediated apoptosis. Moreover, we unveil the action of the M.
ulcerans toxin on collagen biosynthesis. Our findings provide new perspectives on BU
pathogenesis and pave the way for future therapeutic approaches A úlcera do Buruli (UB) é uma doença tropical negligenciada necrotizante da pele, causada pela infeção por Mycobacterium ulcerans. O dano tecidular que caracteriza a doença é causado pela exotoxina lipídica micolactona, que se sabe desempenhar um papel central na patogénese da UB. Contudo, os mecanismos pelos quais a micolactona exerce a sua citotoxicidade são ainda desconhecidos. A elucidação destes mecanismos reveste-se da máxima importância pois poderá levar a novas formas de tratamento da UB, baseadas na neutralização dos efeitos citotóxicos da micolactona. O trabalho experimental realizado no âmbito desta tese teve como objetivo contribuir para a compreensão da citopatogenicidade molecular da micolactona, focando-se na sua potente citotoxicidade. Para este fim, foram seguidas duas abordagens experimentais complementares: estudos in vitro em fibroblastos L929 de ratinho incubados com micolactona purificada e; estudos in vivo com um modelo experimental de UB, a infeção da almofada plantar de ratinho com M. ulcerans. Usando electroforese bidimensional, observámos alterações em vários reguladores e componentes do citoesqueleto, quer de actina quer de tubulina (Dync1i2, Cfl1, Crmp2, Actg1, Stmn1), em células L929 expostas à micolactona, fornecendo novas evidências moleculares para o impacto da micolactona sobre o citoesqueleto, que apresenta desarranjos de conformação, observados por imunofluorescência. Consistentemente, o nosso estudo da autofagia mostrou que a fusão autofagossoma-lisossoma, um processo dependente dos microtúbulos e do transporte mediado pela dineína, é inibida pela micolactona. Em concordância com a deficiência da dinâmica e funções do citoesqueleto em células expostas à micolactona, demonstrámos que ambas as proteínas BH3-only associadas ao citoesqueleto (BIM e BMF) são responsivas ao stress celular induzido pela micolactona, estando aumentadas em células L929 expostas à toxina purificada, bem como em almofadas plantares de ratinhos infectados com estirpe de M. ulcerans produtora de micolactona. Para além disso, o knockdown de Bim protege as células L929 da citotoxicidade induzida pela micolactona, demonstrando que a toxina desencadeia uma via apoptótica intrínseca mediada por BIM. O segundo maior grupo de proteínas com expressão diminuída em células L929 expostas à micolactona compreende enzimas modificadoras do colagénio (Plod1, Plod3, P4ha1) essenciais para a formação e estabilização das fibras de colagénio. Consistentes com um impacto da IX micolactona sobre a estabilidade das fibras de colagénio, análises in vivo no modelo murino de UB revelaram uma degeneração, dependente da micolactona, das fibras de colagénio na derme após a infecção com M. ulcerans. Globalmente, este trabalho fornece novos dados sobre o mecanismo citotóxico da micolactona, o fator chave da patogenicidade de M. ulcerans. Propomos, assim, que a micolactona induz alterações não funcionais do citoesqueleto, afetando as funções dependentes deste e, consequentemente, a homeostasia celular, desencadeando uma apoptose mediada por BIM. Para além disso, revelámos a ação da toxina do M. ulcerans sobre a biossíntese de colagénio. Os nossos resultados fornecem novas perspectivas sobre a patogénese da UB e abrem caminho para futuras abordagens terapêuticas. |
Tipo: | Tese de doutoramento |
Descrição: | Tese de doutoramento em Ciências da Saúde |
URI: | https://hdl.handle.net/1822/33045 |
Acesso: | Acesso restrito UMinho |
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