Molecular cytopathogenesis induced by the Mycobacterium ulcerans toxin, mycolactone

Abstract

Buruli ulcer (BU) is a tropical neglected, necrotizing skin disease caused by Mycobacterium ulcerans infection. The tissue damage that characterizes the disease is driven by the lipidic exotoxin mycolactone, which is known to play a central role in the pathogenesis of BU. However, the mechanisms by which mycolactone exerts its cytotoxicity are still unknown. Uncovering these mechanisms could lead to new forms of BU treatment, based on the neutralization of the mycolactone cytotoxic effects. The research conducted in the scope of this thesis aimed at increasing our understanding of the molecular cytopathogenicity of mycolactone, focusing on its potent cytotoxicity. To this end, two complementary experimental approaches were followed: in vitro studies on L929 mouse fibroblasts incubated with purified mycolactone and; in vivo studies in an experimental model of BU disease, the mouse footpad infection with M. ulcerans. Using two-dimensional gel electrophoresis, we found several regulators and constituents of both actin- and tubulin-cytoskeleton (Dync1i2, Cfl1, Crmp2, Actg1, Stmn1) altered in mycolactone-exposed L929 cells, providing new molecular evidences for the impact of mycolactone upon cytoskeleton, which present conformational disarrangements, as observed by immunofluorescence. Consistently, our study of autophagy showed that autophagosomelysosome fusion, a process dependent on microtubule and dynein-driven transport, is inhibited by mycolactone. In agreement with the impairment of cytoskeleton dynamics and functions in mycolactone-exposed cells, we found that both cytoskeleton-associated BH3-only proteins (BIM and BMF) are responsive to the cellular stress induced by mycolactone, being up-regulated in L929 cells exposed to purified toxin, as well as in mycolactone-producing M. ulcerans-infected mouse footpads. Importantly, the knockdown of Bim protected L929 cells from mycolactoneinduced cytotoxicity, demonstrating that the toxin triggers an intrinsic apoptotic pathway mediated by BIM. The second larger group of proteins found down-regulated in mycolactone-exposed L929 cells comprises collagen-modifying enzymes (Plod1, Plod3, P4ha1) essential for the formation and stabilization of collagen fibers. Consistent with a mycolactone impact upon the collagen fibers stability, in vivo analyses in the BU mouse model revealed a mycolactone-dependent degeneration of dermal collagen fibers upon infection with M. ulcerans.VII Overall, this work provides new insights on the cytotoxic mechanisms of mycolactone, the key pathogenic factor of M. ulcerans. We propose that mycolactone induces nonfunctional cytoskeletal alterations, affecting cytoskeleton-dependent functions and, consequently, cellular homeostasis, triggering a BIM-mediated apoptosis. Moreover, we unveil the action of the M. ulcerans toxin on collagen biosynthesis. Our findings provide new perspectives on BU pathogenesis and pave the way for future therapeutic approaches

A úlcera do Buruli (UB) é uma doença tropical negligenciada necrotizante da pele, causada pela infeção por Mycobacterium ulcerans. O dano tecidular que caracteriza a doença é causado pela exotoxina lipídica micolactona, que se sabe desempenhar um papel central na patogénese da UB. Contudo, os mecanismos pelos quais a micolactona exerce a sua citotoxicidade são ainda desconhecidos. A elucidação destes mecanismos reveste-se da máxima importância pois poderá levar a novas formas de tratamento da UB, baseadas na neutralização dos efeitos citotóxicos da micolactona. O trabalho experimental realizado no âmbito desta tese teve como objetivo contribuir para a compreensão da citopatogenicidade molecular da micolactona, focando-se na sua potente citotoxicidade. Para este fim, foram seguidas duas abordagens experimentais complementares: estudos in vitro em fibroblastos L929 de ratinho incubados com micolactona purificada e; estudos in vivo com um modelo experimental de UB, a infeção da almofada plantar de ratinho com M. ulcerans. Usando electroforese bidimensional, observámos alterações em vários reguladores e componentes do citoesqueleto, quer de actina quer de tubulina (Dync1i2, Cfl1, Crmp2, Actg1, Stmn1), em células L929 expostas à micolactona, fornecendo novas evidências moleculares para o impacto da micolactona sobre o citoesqueleto, que apresenta desarranjos de conformação, observados por imunofluorescência. Consistentemente, o nosso estudo da autofagia mostrou que a fusão autofagossoma-lisossoma, um processo dependente dos microtúbulos e do transporte mediado pela dineína, é inibida pela micolactona. Em concordância com a deficiência da dinâmica e funções do citoesqueleto em células expostas à micolactona, demonstrámos que ambas as proteínas BH3-only associadas ao citoesqueleto (BIM e BMF) são responsivas ao stress celular induzido pela micolactona, estando aumentadas em células L929 expostas à toxina purificada, bem como em almofadas plantares de ratinhos infectados com estirpe de M. ulcerans produtora de micolactona. Para além disso, o knockdown de Bim protege as células L929 da citotoxicidade induzida pela micolactona, demonstrando que a toxina desencadeia uma via apoptótica intrínseca mediada por BIM. O segundo maior grupo de proteínas com expressão diminuída em células L929 expostas à micolactona compreende enzimas modificadoras do colagénio (Plod1, Plod3, P4ha1) essenciais para a formação e estabilização das fibras de colagénio. Consistentes com um impacto da IX micolactona sobre a estabilidade das fibras de colagénio, análises in vivo no modelo murino de UB revelaram uma degeneração, dependente da micolactona, das fibras de colagénio na derme após a infecção com M. ulcerans. Globalmente, este trabalho fornece novos dados sobre o mecanismo citotóxico da micolactona, o fator chave da patogenicidade de M. ulcerans. Propomos, assim, que a micolactona induz alterações não funcionais do citoesqueleto, afetando as funções dependentes deste e, consequentemente, a homeostasia celular, desencadeando uma apoptose mediada por BIM. Para além disso, revelámos a ação da toxina do M. ulcerans sobre a biossíntese de colagénio. Os nossos resultados fornecem novas perspectivas sobre a patogénese da UB e abrem caminho para futuras abordagens terapêuticas.