A systems biology approach for the characterization of metabolic bottlenecks in recombinant protein production processes

Abstract

The main purpose of this thesis is to investigate the influence of recombinant protein production in the reorganization of the metabolic activities and the resulting stress-induced responses in the bacterium Escherichia coli. More specifically, the focus is on the RelA-mediated stringent response, a stress response that is triggered by the sudden lack of intracellular amino acids and that has been associated with the metabolic burden imposed by recombinant processes. To identify the main metabolic bottlenecks in recombinant biosynthetic processes, which include maintenance of recombinant DNA and expression of heterologous genes, a systematic modelling approach is proposed, capable of predicting the amino acid shortages caused by recombinant processes and the consequent activation of the RelA-dependent guanosine pentaphosphate (ppGpp) synthesis. The view of ppGpp as a primarily regulator of gene transcription has been expanded and it is now clear that the response controlled by ppGpp is crucial for cell survival during the adaptation to stressful conditions. Major advances have been achieved to understand this regulatory system governing gene expression in response to environmental growth perturbations, but so far mainly transcriptome and proteome analyses that have been applied to elucidate the stringent control mediated by ppGpp. Metabolomics analysis can provide substantial information on the impact of this stress response at the biochemical level, in particular during recombinant bioprocesses. Therefore, two metabolomics-based approaches were applied: metabolic profiling to evaluate the intracellular metabolic profiles and metabolic footprinting to estimate the profiles of extracellular metabolites. In these metabolomics studies two E. coli strains (E. coli W3110 and the isogenic ΔrelA mutant) were used to investigate the influence of recombinant processes on the host cells’ metabolism, as well as the main metabolic activities affected by the RelA activity under different growth conditions. The mutant strain presented a “relaxed” phenotype that characterized this bacterial system by an acute delay in most metabolic adaptations to transient growth conditions. Most importantly, it was shown that these mutant cells lack metabolic adjustments that are often observed after metabolic burden phenomena. Nevertheless, this cellular system presented major advantages in terms of biomass yield and productivity, which imply a remarkable improvement in recombinant bioprocesses. Thus, alleviating stress responses can be beneficial if they impair the desired quality and quantity of the recombinant product. However, it must be pointed out that this may be an alternative as long as recombinant bioprocesses are designed to achieve a finer balance between strain improvement strategies and culturing conditions.

O trabalho realizado no âmbito desta tese teve como principal finalidade a avaliação das alterações metabólicas relacionadas com a produção de proteínas recombinantes em células bacterianas de Escherichia coli e a consequente activação de respostas de stress. Foi evidenciada a resposta restringente promovida pela actividade da enzima RelA, dado ser uma das principais respostas de stress induzidas pelo decréscimo da quantidade de aminoácidos disponíveis no meio intracelular como consequência da expressão de proteínas recombinantes. As diferenças na composição em aminoácidos entre as proteínas da biomassa e recombinantes, têm sido apontadas como principais causas para o desequilíbrio metabólico que conduz à exaustão de alguns metabolitos, nomeadamente de aminoácidos. De modo a explorar estes fenómenos e avaliar o impacto dos processos recombinantes no metabolismo das células hospedeiras, foi proposto um modelo matemático capaz de identificar pontos de estrangulamento na rede metabólica. Estes locais correspondem a vias metabólicas que apresentam limitações na capacidade catalítica e que serão essenciais para compensar o consumo desproporcionado de aminoácidos levado a cabo pela síntese de proteínas recombinantes. Associado a este fenómeno foi considerada a descrição da síntese de nucleótidos guanosina pentafosfato (ppGpp) induzida pela escassez de aminoácidos no meio intracelular. O reconhecimento deste nucleótido como um regulador fundamental na transcrição da informação genética tem sido amplamente descrito e tornou-se evidente que as respostas celulares controladas pelo ppGpp são determinantes para a sobrevivência e adaptação dos organismos a condições adversas. Neste sentido, vários estudos foram elaborados para elucidar o papel do ppGpp no controlo destas respostas de stress e nas alterações fisiológicas que advêm destes processos, nomeadamente ao nível do metabolismo. A análise do metaboloma, em comparação com o transcriptoma ou o proteoma, é capaz de capturar de forma mais directa a relação entre as actividades metabólicas e a fisiologia dos organismos, designadamente em sistema recombinantes. Neste trabalho foram elaborados alguns estudos em que se aplicaram duas abordagens de análise metabolómica distintas: profiling metabólico, que se refere à análise do perfil de metabolitos intracelulares; e footprinting metabólico, que se refere à análise do perfil de metabolitos extracelulares. Nestes estudos foram usadas duas estirpes de E. coli (W3110 e a estirpe isogénica com mutação no gene relA) clonadas com um vector de expressão pTRC-His- AcGP1 que codifica a proteína verde fluorescente AcGFP1, derivada da proteína AcGFP da Aequorea coerulescens. Foram avaliadas as principais alterações metabólicas provocadas pela indução da produção de proteína recombinante e pela actividade catalítica da enzima RelA em diversas condições de crescimento. Comparando os perfis metabólicos das duas estirpes, foram estimadas várias diferenças significativas que se podem revelar críticas durante processos recombinantes. A estirpe mutante revelou um comportamento típico de um fenótipo “relaxado”, que é caracterizado por um retardamento significativo na adaptação do metabolismo a alterações nas condições de crescimento. Não obstante, a estirpe mutante exibiu melhores resultados em termos de rendimento em biomassa e produtividade, o que representa uma vantagem notável para a aplicação destes sistemas bacterianos recombinantes ao nível industrial. Em resumo, a restrição de respostas de stress pode trazer benefícios se a qualidade e quantidade do produto estiverem em causa, mas deve salientar-se que não é uma solução absoluta, sendo que as condições de processamento devem ser também levadas em consideração na implementação destes bioprocessos.