Dissecting the transcriptional program of Prrxl1 transcription factor in the development of dorsal root ganglion nociceptors

Abstract

Os neurónios do gânglio raquidiano percecionam vários estímulos externos e internos através de fibras que inervam perifericamente, que são transmitidos para a medula espinal, seguindo para regiões específicas do cérebro, permitindo a perceção sensorial e respostas motoras. O gânglio contendo corpos celulares de neurónios periféricos, pode ser dividido em subpopulações como os proprioceptores, que sentem o movimento dos membros, os mecanorreceptores, que sentem o tato, e os nociceptores, que sentem estímulos nocivos. Embora se saiba muito sobre os fatores de transcrição (FTs) necessários para o desenvolvimento das subpopulações neuronais no gânglio, os mecanismos moleculares subjacentes à sua função na diferenciação neuronal ainda não são claros. Prrxl1 é um FT de homeodomínio expresso nos nociceptores do gânglio e nos neurónios excitatórios do corno dorsal da medula espinal. Sabe-se que o Prrxl1 é necessário para a diferenciação neuronal, migração, orientação axonal e formação do circuito gânglio-medula. Para compreender a rede transcricional de Prrxl1 sob a regulação no gânglio em desenvolvimento, o nosso grupo realizou um estudo que combinou imunoprecipitação da cromatina seguido de sequenciação de nova geração (ChIP-Seq) com perfis de expressão de microarray em embriões de ratinho knockout para Prrxl1 e selvagens a E14.5, criando uma lista de genes putativos diretamente regulados por Prrxl1. Neste estudo, pretendemos validar um subconjunto desses genes através da (i) análise da co-expressão dos genes com Prrxl1, combinando hibridação in situ (HIS) com imunofluorescência, e (ii) análise da expressão de genes-alvo por RT-qPCR e HIS em Prrxl1 -/- e de tipo selvagem a E14.5. Observámos uma co-expressão extensiva do FT Ldb2, do neuropéptido Adcyap1 do canal iónico Trpv1, do recetor de glicina Glra2, do recetor de sinalização Dcc e do recetor de glutamato Gria1 com Prrxl1, regulando positivamente Adcyap1, Ldb2, Trpv1 e negativamente Glra2 e Dcc. Prrxl1 regula negativamente o canal iónico Htr3a e a molécula de orientação axonal Slit2 enquanto induz a expressão da molécula de orientação axonal Slit1. No entanto, estes genes não foram ainda associados a uma linhagem sensorial. Por último, descobrimos que as moléculas de sinalização Chodl e Calb1, e o canal iónico Accn2, marcadores de mecano e/ou proprioceptores maduros, estavam parcialmente ou não co-expressavam com Prrxl1, sendo reguladas negativamente por este. Além disso, Prrxl1 reprime outros genes marcadores dessas populações, como o FT Shox2 e as moléculas de sinalização Whrn e Pvalb. Assim, estes resultados sugerem que o Prrxl1 é necessário para diferenciar nociceptores imaturos em subtipos que expressam Adcyap1, Ldb2, Slit1, Trpv1 e Gria1, reprimindo, ao mesmo tempo, a expressão de Glra2, Dcc, Htr3a e Slit2. Curiosamente, também indicaram que o Prrxl1 é necessário para a repressão de genes marcadores de mecano e/ou proprioceptores, favorecendo um destino nociceptivo.

Dorsal root ganglion (DRG) neurons transduce various external and internal stimuli through peripheral innervating fibers. These signals are transmitted to the spinal cord (SC) and then to specific brain regions, enabling sensory perception and motor responses. DRG contains the cells bodies of peripheral neurons that could be divided in subpopulations like proprioceptors, which sense limb movement, mechanoreceptors, which sense touch, and nociceptors that sense noxious stimuli. Even though much is known about transcription factors (TFs) required for the neuronal development subpopulations in the DRG, the molecular mechanisms underlying TFs’ function on neuronal differentiation are still unclear. Prrxl1 is a homeodomain TF specifically expressed in both DRG nociceptors and excitatory neurons of the dorsal SC. It is known that Prrxl1 is required for proper neuronal differentiation, migration, axon guidance and assembly of DRG-spinal circuit. To understand the transcriptional network under the regulation of Prrxl1 in the developing DRG neurons, our group performed a genome-wide study combining chromatin immunoprecipitation assays followed by next generation sequencing (ChIP-Seq) with microarray expression profiling in Prrxl1 -/- and wild type mouse embryos at E14.5, generating a list of putatively direct target genes of Prrxl1. In this study we aimed at validating a subset of representative Prrxl1 putative target genes in the DRG through (i) co-expression analysis of the target genes with Prrxl1 by combining in situ hybridization (ISH) with immunofluorescence, and (ii) target gene expression analysis by RT-qPCR and ISH in Prrxl1 -/- and wild type E14.5 mouse embryos. We observed extensive co-expression of TF Ldb2, neuropeptide Adcyap1, ion channel Trpv1, glycine receptor Glra2, signalling receptor Dcc and glutamate receptor Gria1 with Prrxl1. Moreover, Prrxl1 positively regulates Adcyap1, Ldb2, Trpv1 while repressing Glra2 and Dcc expression. We also observed that Prrxl1 is capable of negatively regulate the ligand gate ion channel Htr3a and axon guidance molecule Slit2 while inducing axon guidance molecule Slit1 expression. However, these genes were not yet associated with a sensory lineage. Lastly, we found that signalling molecules Calb1 and Chodl and ion channel Accn2, which are markers of mature mechanoreceptors and/or proprioceptors, were partially co-expressed or not co-expressed with Prrxl1 and were also negatively regulated by Prrxl1. In addition, Prrxl1 can also repress other marker genes of those populations such as TF Shox2 and signalling molecules Whrn, and Pvalb. Together these results suggest that Prrxl1 is necessary for immature nociceptors to differentiate into nociceptor subtypes expressing Adcyap1, Ldb2, Slit1, Trpv1, and Gria1, while repressing Glra2, Dcc, Htr3a and Slit2. Interestingly, our data also indicates that Prrxl1 is required to suppress the expression of mechanoreceptor and/or proprioceptor marker genes, thus favouring a nociceptor fate.