Development of new generation polymyxins to combat biofilm-associated respiratory infections

Abstract

Os antibióticos desempenham um papel importante nos cuidados de saúde devido à sua capacidade de tratar as infeções bacterianas de forma rápida e eficaz. No entanto, a utilização inadequada e excessiva de antibióticos levou ao desenvolvimento de resistência antimicrobiana, um fenómeno que põe em risco a saúde pública, com um elevado impacto a nível mundial. Com a crescente emergência da resistência antimicrobiana, o interesse pelos péptidos antimicrobianos tem-se intensificado. Entre estes, as polimixinas, uma antiga classe de antibióticos, ressurgiram como uma tentativa de último recurso para responder a este fenómeno. As polimixinas B e E são as únicas polimixinas disponíveis clinicamente, sendo a única diferença entre elas o aminoácido na posição 6 (B: fenilalanina; E: leucina). Porém, para além da sua eficácia, as polimixinas estão associadas a elevados níveis de toxicidade e baixa estabilidade. Para ultrapassar estas limitações, o desenvolvimento de análogos de polimixinas, obtidos através de mudanças na estrutura molecular das polimixinas nativas tem sido estudado. Uma das potenciais alterações que podem ser efetuadas envolve a incorporação de aminoácidos não naturais, como as α,α-dialquilglicinas, em vez dos naturais. Os objetivos deste trabalho consistiram na síntese de duas α,α-dialquilglicinas estruturalmente relacionadas com a leucina e a fenilalanina, nomeadamente a α,α-diisobutilglicina e a α,α-dibenzilglicina. Estas α,α-dialquilglicinas foram usadas na síntese de análogos de polimixinas por substituição dos aminoácidos naturais em posições selecionadas da sequência. Por fim, foi feito o estudo da influência das modificações estruturais na atividade antimicrobiana dos análogos obtidos. As α,α-dialquilglicinas foram sintetizadas utilizando uma reação multicomponente, a reação de Ugi, tendo sido obtidos os produtos pretendidos com bons rendimentos. Os análogos das polimixinas foram obtidos por síntese peptídica em fase sólida assistida por micro-ondas, utilizando a estratégia Fmoc e uma resina de cloreto de tritilo-poliestireno pré-funcionalizada. A técnica de espetrometria de massa permitiu confirmar a obtenção dos análogos desejados. A atividade antimicrobiana dos análogos foi avaliada através da determinação da concentração inibitória mínima e da concentração bactericida mínima contra uma estirpe da bactéria P. aeruginosa. Os análogos mais promissores, que apresentaram valores de concentração inibitória mínima e concentração bactericida mínima mais reduzidos, foram os análogos PMB1 e PME1.

Antibiotics play a significant role in healthcare due to their ability to treat bacterial infections quickly and effectively. However, the inappropriate and excessive use of antibiotics has led to the development of antimicrobial resistance (AMR), a phenomenon that jeopardises public health, with a high impact worldwide. With the growing emergence of AMR, interest in antimicrobial peptides (AMPs) has intensified. Among the AMPs, polymyxins (PMs), an old class of antibiotics, have re-emerged as a last resort attempt to respond to the AMR phenomenon. Polymyxins B (PMB) and E (PME) are the only ones available clinically, the only difference between them being the amino acid at position 6 of the lipopeptide chain (PMB: phenylalanine; PME: leucine). In addition to their efficacy, PMs are associated with high levels of toxicity and low stability. To overcome these limitations, the development of PM analogues obtained by changing the molecular structure of native PMs has been studied. One of the potential changes that can be done involves the incorporation of non-natural amino acids, such as α,α-dialkylglycines (DAGs), instead of natural ones. The aims of this work consisted in the synthesis of two DAGs, structurally related to leucine and phenylalanine, namely α,α-diisobutylglycine and α,α-dibenzylglycine. These DAGs were used in the synthesis of PMs analogues, by substitution of natural amino acids at selected positions of the sequence. Lastly, the influence of the structural modifications on the antimicrobial activity of the obtained analogues was studied. The DAGs were synthesized based on a multicomponent reaction, the Ugi reaction, and the desired products were obtained with good yields. PMs analogues were obtained by microwave-assisted solid-phase peptide synthesis using the Fmoc strategy and a pre-functionalized tritylchloride-polystyrene (TCP) resin. The mass spectrometry technique confirmed that the desired analogues had been obtained. The antimicrobial activity of the analogues was evaluated through determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) and the minimum bactericidal concentration (MBC) against a strain of P. aeruginosa bacteria. The most promising analogues, which showed the lowest MIC and MBC values, were PMB1 and PME1.