Antifungal plant extracts and phytochemicals, mechanisms of action and microbial resistance

Abstract

Um dos maiores desafios do setor agrícola continua a ser o controlo de doenças fúngicas, que afetam significativamente o rendimento das culturas e qualidade dos produtos. O uso contínuo de antifúngicos sintéticos levou ao desenvolvimento de resistências nos patógenos-alvo, tornando necessária a procura por alternativas naturais e sustentáveis. O objetivo deste trabalho foi descobrir antifúngicos que substituam os convencionais, que sejam biodegradáveis e não promovam resistências. Dos seis extratos aquosos e etanólicos de curcuma (CA e CE), noz-moscada (NMA e NME) e manjericão (OA e OE) testados, apenas CE e NME apresentaram toxicidade contra Saccharomyces cerevisiae, chegando a percentagens de viabilidade celular de 2,12% e 1,01%, respetivamente, ao fim de 120 min de exposição a 1000 µg/mL. Também vários fungos e oomicetes fitopatogénicos foram expostos à ação destes extratos, tendo-se obtido as seguintes inibições máximas do crecimento micelial com CE e NME para cada um deles: Botrytis cinerea 36,14% e 21.00%; Colletotrichum acutatum 23.23% e 10.74%; Diplodia corticola 34,32% e 27,73%; Fusarium culmorum 47,79% (só NME); Phytophthora cactorum 41.29% (só CE); e Phytophthora cinnamomi 65,88% e 25,23%, respetivamente. Os mecanismos de ação dos extratos foram estudados através de ensaios de viabilidade com mutantes de S. cerevisiae associados à via de síntese do ergosterol, à integridade da parede celular e ao processo de apoptose, tendo-se também estudado a viabilidade celular por microscopia de fluorescência. Os resultados sugerem que os extratos afetam a via biossintética do ergosterol, sendo os possíveis alvos a enzima esterol C-24 metiltransferase, o fecosterol e o episterol. Há também indícios de que CE causa a sobreativação da via de integridade da parede celular e que ambos os extratos provocam necrose. A toxicidade dos extratos foi testada na germinação de alface in vitro (250 e 500 µg/mL) e CE demonstrou não ser tóxico, ao contrário de NME. A capacidade de CE induzir resistência em células de S. cerevisiae foi estudada expondo as células a valores inferiores, iguais e superiores à concentração mínima inibitória (MIC) deste extrato (6,25, 12,50 e 50,00 µg/mL) e constatou-se que CE não induz resistência até concentrações iguais à MIC. A análise química revelou que CE é rico em (+)-β-turmerona, enquanto NME contém ácido mirístico em maior proporção. Em suma, este trabalho mostrou que os extratos CE e NME são promissores para serem utilizados como fungicidas naturais sem promoverem resistências nos organismos alvo.

One of the biggest challenges facing the agricultural sector continues to be the control of fungal diseases, which significantly affect crop yields and product quality. The continuous use of synthetic antifungals has led to the development of resistance in the target pathogens, making it necessary to look for natural and sustainable alternatives. The aim of this work was to find antifungals that replace conventional ones, are biodegradable and do not promote resistance. From the six aqueous and ethanolic extracts of turmeric (CA and CE), nutmeg (NMA and NME) and basil (OA and OE) tested, only CE and NME showed toxicity against Saccharomyces cerevisiae, reaching percentages of cell viability of 2.12% and 1.01%, respectively, after 120 min of exposure to 1000 µg/mL. Several phytopathogenic fungi and oomycetes were also exposed to the action of these extracts, and the following maximum inhibitions of mycelial growth were obtained with CE and NME for each of them: Botrytis cinerea 36.14% and 21.00%; Colletotrichum acutatum 23.23% and 10.74%; Diplodia corticola 34.32% and 27.73%; Fusarium culmorum 47.79% (NME only); Phytophthora cactorum 41.29% (CE only); and Phytophthora cinnamomi 65.88% and 25.23%, respectively. The extracts' mechanisms of action were studied through viability tests with S. cerevisiae mutants associated with the ergosterol synthesis pathway, cell wall integrity and the apoptosis process, and cell viability was also studied using fluorescence microscopy. Results suggest that the extracts affect the ergosterol biosynthetic pathway, being the possible targets sterol C-24 methyltransferase enzyme, fecosterol and episterol. There is also indications that CE causes overactivation of the cell wall integrity pathway and that both extracts cause necrosis. The toxicity of the extracts was tested on lettuce germination in vitro (250 and 500 µg/mL) and CE proved not to be toxic, unlike NME. The ability of CE to induce resistance in S. cerevisiae cells was studied by exposing the cells to values below, equal to and above the minimum inhibitory concentration (MIC) of this extract (6.25, 12.50 and 50.00 µg/mL) and it was found that CE does not induce resistance up to concentrations equal to the MIC. Chemical analysis revealed that CE is rich in (+)-β-turmerone, while NME contains a higher proportion of myristic acid. In short, this work has shown that CE and NME extracts are promising for use as natural fungicides without promoting resistance in target organisms.