Engineering plasma membrane transporters to improve organic acid production

Abstract

Microbially produced organic acids play an important role in the global transition to a circular economy by replacing petroleum-based raw materials in the chemical industry. Among them, succinic acid is especially attractive as it can be converted into numerous industrially important chemicals and materials. Yeasts are particularly desirable microbial hosts for succinic acid production because they tolerate low environmental pH and therefore allow the direct production of the undissociated form of the acid, which results in a significantly simpler and cheaper overall process. The fermentation performance of yeast cell factories greatly relies on the activity of membrane transporters as they are responsible for the import of substrates, the exchange of metabolites between intracellular compartments, and the export of succinic acid out of the cell. As such, they represent important targets in metabolic engineering endeavours and were the main focus of this thesis. Ato1 (also known as Ady2), a plasma membrane transporter of monocarboxylic acids from Saccharomyces cerevisiae, was selected as a target for rational mutagenesis. Mutations increasing the pore size of Ato1, namely the single amino acid substitutions F98A, L219A, L219G, and L219S, allowed it to take up succinic acid. Moreover, the transport activity of Ato1 was significantly increased by introducing the E144A amino acid substitution located in the cytosolic loop. A further reengineering of Ato1 converted it into a hyperactive transporter of succinic acid by combining the L219A and E144A substitutions. The homologue of Ato1 from Escherichia coli (SatP) was functionally expressed in S. cerevisiae, where it mediated an efficient uptake of monocarboxylic acids. Succinic acid transport activity was established in SatP by introducing the L131A amino acid substitution within the central constrictive site of its pore. To test whether these Ato1 and SatP variants could function as efficient succinic acid exporters, they were expressed in a S. cerevisiae strain that was engineered for succinic acid overproduction. Their impact on extracellular succinic acid accumulation was compared to that of Dct-02, a known exporter of succinic acid from Aspergillus niger. In contrast to Dct-02, the Ato1 and SatP variants hindered the extracellular accumulation of succinic acid because these transporters favoured succinic acid import rather than export under conditions of low pH. The data indicated that the engineered Ato1 and SatP variants mediated the uniport of monovalent succinate anions, while Dct-02 mediated the uniport of divalent anions, which strongly affects the direction of succinic acid transport at low pH. The obtained results in this study also indicated that S. cerevisiae possesses unknown endogenous exporter(s) of succinic acid in its plasma membrane since the cells that were not equipped with Dct-02 still accumulated significant amounts of succinic acid in the medium. This project also contributed to the development of a novel S. cerevisiae strain that produced succinic acid from glycerol and carbon dioxide via the reductive branch of the TCA cycle (rTCA pathway). The resulting UBR2CBS-DHA-SA-AnDCT-02 (2)- PYC2oe strain achieved a maximum succinic acid yield of 0.60 g/g of glycerol, which is above the yields that were previously reported for the yeast strains used in the industry. To further improve the succinic acid production in the above-mentioned strain, a metabolic engineering strategy was applied based on reducing the excessive activity of the oxidative TCA cycle and increasing the flux of carbon through the cytosolic rTCA pathway. The deletion of the MPC3 gene, which encodes a subunit of the respiratory mitochondrial pyruvate carrier complex, caused a ∼ 13% increase in the obtained succinic acid yield by reducing the influx of pyruvate into the mitochondria. Additionally, the deletion of the SDH1 gene caused a ∼ 19% increase in the obtained succinic acid yield by disrupting the conversion of mitochondrial succinic acid into fumaric acid via the SDH complex. This disruption also led to a decreased production of malic acid, which is an unwanted byproduct during succinic acid production. Overall, extensive knowledge was obtained about the mode of action and structural features of plasma membrane transporters involved in the transport of organic acids. Major improvements in succinic acid production from glycerol were achieved by engineering the metabolism and metabolite transport in S. cerevisiae.

Os ácidos orgânicos produzidos por via microbiana desempenham um papel importante na transição global para uma economia circular, substituindo na indústria química as matérias-primas à base de petróleo. Entre estes, o ácido succínico é especialmente interessante, pois pode ser convertido em vários produtos químicos, industrialmente relevantes. As leveduras são hospedeiros microbianos particularmente atraentes para a produção de ácido succínico por tolerarem valores de pH ambiental baixos e, consequentemente, permitirem a produção direta da forma não dissociada do ácido, o que resulta num processo globalmente mais simples e com custos significativamente mais reduzidos. O desempenho da levedura como fábrica celular é dependente da atividade dos transportadores de membrana, sendo estes responsáveis pelo importe de substratos, troca de metabolitos entre compartimentos intracelulares e exporte de ácido succínico para o meio extracelular. Assim, as proteínas membranares são alvos de interesse nos processos de engenharia metabólica e constituíram o foco principal desta tese. O transportador de membrana plasmática de ácidos monocarboxílicos de Saccharomyces cerevisiae Ato1 (também designado como Ady2) foi selecionado como alvo para mutagénese dirigida. Mutações associadas com o aumento da dimensão do poro deste transportador, nomeadamente as substituições isoladas dos aminoácidos F98A, L219A, L219G e L219S promoveram o transporte de ácido succínico. Além disso, a capacidade de transporte foi significativamente aumentada aquando da substituição por alanina do resíduo E144, localizado no loop citosólico. A combinação das substituições L219A e E144A converteram o transportador Ato1 num transportador hiperativo de ácido succínico. O homólogo de Ato1 de Escherichia coli (SatP) foi expresso em S. cerevisiae, apresentado atividade para o transporte de ácidos monocarboxílicos. A atividade de transporte de ácido succínico no SatP foi promovida pela substituição L131A, um resíduo localizado na constrição do poro central da proteína. No sentido de verificar se as variantes de Ato1 e SatP poderiam funcionar como exportadores eficientes de ácido succínico, estas foram expressas numa estirpe de S. cerevisiae concebida, por engenharia metabólica, para a sobreprodução de ácido succínico. Para aferir o seu impacto na acumulação extracelular de ácido succínico, foi feita a comparação com a expressão funcional de Dct 02, um exportador de ácido succínico de Aspergillus niger. Contrariamente à estirpe contendo Dct-02, em condições de pH baixo, as estirpes que expressaram as variantes Ato1 e SatP revelaram-se ineficazes na acumulação extracelular de ácido succínico, presumivelmente porque estes transportadores favoreceram o importe do ácido em vez do seu exporte. Os resultados obtidos indicaram que os alelos mutantes do Ato1 e SatP mediaram o uniporte do monoanião de succinato, enquanto que o Dct-02 mediou o uniporte de dianiões, afetando de forma significativa a direção do transporte de ácido succínico nas condições de pH extracelular baixo. Os resultados obtidos neste estudo também indicaram que S. cerevisiae possui na membrana plasmática exportador(es) endógeno(s) desconhecido(s) de ácido succínico, uma vez que as células que não expressam o Dct-02 ainda acumularam quantidades significativas de ácido succínico no meio extracelular. Neste projeto procedeu-se ao desenvolvimento de uma nova estirpe de S. cerevisiae produtora de ácido succínico a partir de glicerol e dióxido de carbono através da via redutora do ciclo dos ácidos tricarboxílicos TCA (via rTCA). Com a estirpe UBR2CBS-DHA SA-AnDCT-02 (2)-PYC2oe atingiu-se o rendimento máximo de ácido succínico de 0.60 g/g de glicerol, valor acima dos reportados anteriormente para a estirpe de levedura usada na indústria. Para otimizar a produção de ácido succínico na estirpe acima mencionada, foi estabelecida uma estratégia de engenharia metabólica baseada na redução da atividade excessiva do ciclo oxidativo do TCA e no aumento do fluxo de carbono pela via citosólica do rTCA. A deleção do gene MPC3, que codifica para uma subunidade do complexo respiratório do transportador mitocondrial de piruvato, conduziu ao aumento de ∼ 13% no rendimento de ácido succínico, em consequência da redução do influxo de piruvato na mitocôndria. Por sua vez, a deleção do gene SDH1 causou um aumento de ∼ 19% no rendimento de ácido succínico, promovido pela interrupção da conversão mitocondrial do ácido succínico em ácido fumárico via complexo SDH. Esta estratégia levou à diminuição da produção de ácido málico, um subproduto indesejado durante a produção de ácido sucínico. No geral, com este trabalho, aprofundou-se o conhecimento sobre o modo de ação e as características estruturais de transportadores de ácidos orgânicos da membrana plasmática. Foram atingidas otimizações significativas na produção de ácido succínico a partir do glicerol, através de processos de engenharia metabólica e da manipulação de proteínas transportadoras de metabolitos em S. cerevisiae.