Novel hapten synthesis for antibody generation and development of immunoassays for analysis of Se in Se-rich products

Abstract

O selénio (Se) é um elemento vestigial essencial com vários benefícios para a saúde. O défice de Se relaciona-se com o risco de doenças cardíacas, imunológicas, e neurológicas, tal como o hipotiroidismo, levando à intensa comercialização de produtos ricos em Se. Porém, a quantificação de Se de forma precisa e exata é extremamente desafiadora e recorre a abordagens demoradas, complexas, custosas e ineficientes. Portanto, é urgente uma nova estratégia de deteção do Se rápida, sensível, específica, precisa e de alto rendimento. Este trabalho apresenta um novo e completo processo de deteção de Se. Dois haptenos de Se foram preparados para o acoplamento de bioconjugados correspondentes, denominados de antígenio 1 e 2, seguindo-se a estimulação de clones por ambos os antigénios. Apenas um clone (5A5 2 ) atendeu aos requisitos — o anticorpo monoclonal (mAb) mostrou menor IC50 e ausência de reatividade cruzada (CR) com o ligante. Um ensaio imunoenzimático competitivo indireto (ic-ELISA) (faixa de deteção de 17-207 pmol mL -1 e um limite de deteção (LOD) de 3.9 pmol mL -1 ) foi desenvolvido e não foram encontradas evidências de CR com iões e ligantes representativos. As recuperações gerais para quatro espécies de Se: selenito (SeO3 2-), selenato (SeO4 2-), selenocisteína (SeCys) e selenometionina (SeMet), foram conseguidas entre 80 % e 108 %, com seus respetivos coeficientes de variação (CVs) entre 2.7 % e 11 %. A correlação e a inclinação entre o ic-ELISA e a espectroscopia de absorção atómica (AAS) foram de 0.991 e 0.866, respetivamente (amostras=10). Além disso, criou-se um ensaio imunoenzimático de sandwich mediado por um agente bifuncional (bts-ELISA), evidenciando elevada sensibilidade (119.2 fmol mL -1 — 32.7 vezes mais do que o ic-ELISA). As recuperações gerais das várias formas de Se foram entre 75.4 % e 104.1%, com seus CVs variando de 3.1 % a 19.0. A inclinação e o coeficiente de correlação entre o bts-ELISA e AAS foram 0.808 e 0.951, respetivamente (amostras=8). Finalmente, reportou-se o desenvolvimento de um imunoensaio de fluxo lateral (LFIA) para a semi-quantificação de Se em suplementos contendo este elemento (LOD de 0.24 nmol mL -1 ; valor de corte visual de 10 nmol mL -1 ). Pela primeira vez, desenvolveu-se um imunoensaio simples, rápido, de elevada sensibilidade e boa repetibilidade para detetar Se, com grande importância analítica prática em produtos ricos em Se.

Selenium (Se) is an essential trace element vital for health. Se deficiency is linked to an increased risk of several heart, immune and neurological diseases, there by leading to an aggressive market of Se-rich products. However, quantifying Se accurately in these products during manufacture can be exceedingly challenging, relying on time-consuming and costly instrumental methods. Consequently, there is an urgent need for a novel detection strategy that is rapid, sensitive, specific, accurate, and high throughput. This thesis hence presents a complete Se detection schedule. Two types of Se-haptens with modifications were synthesized for preparation of their corresponding bioconjugates, namely antigen 1 and antigen 2, following the stimulation of clones by both antigens. Only one clone (5A5 2 ) met the requirements, with monoclonal antibody (mAb) showing the lowest IC50 and no cross-reactivity (CR) with the ligand. An indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ic-ELISA) (detection range of 17-207 pmol mL -1 and a limit of detection (LOD) of 3.9 pmol mL -1 ) was achieved under optimal conditions. No evident CR with representative ions and ligands was found. The recoveries for four Se species: selenite (SeO3 2-), selenate (SeO4 2-), selenomethionine (SeMet), and selenocystine (SeCys), were determined to be between 80 % and 108 %, with their related coefficients of variation (CVs) ranging from 2.7 % to 11 %. The correlation and slope between ic-ELISA and atomic absorption spectroscopy (AAS) analysis were 0.991 and 0.866, respectively, in the determination of Se in Se-rich products. (samples=10). Furthermore, a novel bifunctional tracer-mediated sandwich ELISA (bts-ELISA) was developed with ultra-sensitivity of 119.2 fmol mL -1 (32.7 times more sensitive than the ic-ELISA). The recoveries for the four Se species were found to be between 75.4 % and 104.1%, with their relevant CVs ranging from 3.1 % and 19.0 %. The correlation coefficient and slope between bts-ELISA and the AAS technique were determined to be 0.951 and 0.808, respectively (samples=8). Finally, a lateral flow immunoassay (LFIA) was developed for semi-quantifying Se in Se supplements (LOD value of 0.24 nmol mL -1 and a visual cut-off value of 10 nmol mL -1 ). For the first time, an immunoassay for Se with simplicity, rapidity, sensitivity, and good repeatability was developed, which has a significant practical importance.