Designing RNA based biopesticides for the control of cork oak phytopathogens

Abstract

Cork oak (Quercus suber L.) is an evergreen tree species with a great ecological and economic impact along the Mediterranean basin. Although being widely distributed, Q. suber forest has been declining for the past 80 years, being further enhanced by the climate changes. An example is severe drought, which is exposing cork oaks to an extra layer of stress allowing opportunistic pathogenic attacks. An example is the charcoal diseases caused by Biscogniauxia mediterranea, and bot canker caused by Diplodia corticola. The lack of a specific treatment for both diseases and the progressive ban of chemical fungicides in the EU, calls for new and innovative alternatives. In this context, RNA interference (RNAi) based fungicides are a promising strategy. Spray-induced gene silencing (SIGS) is a state-of-the-art RNAi silencing approach that targets specific pathogen genes, following the spraying of the host plant with a solution containing double stranded RNA (dsRNA). In this work, the possibility of using such approach for controlling both cork oak pathogens was explored. For the success of this biotechnological solution, the pathogen needs to uptake dsRNA molecules and process them for silencing targeted genes. In silico results revealed that both B. mediterranea and D. corticola contained the required protein machinery to uptake and process exogenous dsRNA. This result was corroborated by testing the capacity of both fungi in uptaking a labelled sGFT-dsRNA and by using an in vitro assay with sGFP transformants for testing silencing machinery. After testing the designed dsRNAs for fungal growth impairment, differences were detected in both cork oak pathogens. B. mediterranea appears to be more recalcitrant to the use of a SIGS approach than D. corticola. This work provided evidences of the potential of SIGS in controlling cork oak pathogens, particularly D. corticola.

O sobreiro (Quercus suber L.) é uma espécie arbórea perene com grande impacto ecológico e económico presente na bacia mediterrânica. Apesar de amplamente distribuída, a floresta Q. suber tem vindo nos últimos 80 anos a apresentar indícios de declínio, potencializado pelas alterações climáticas. Um exemplo destas condições é a seca severa, que expõe os sobreiros a uma camada extra de stress o que permite ataques por patógenos oportunistas. Exemplos de doenças causadas por estes ataques são a doença do carvão do entrecasco causada pelo fungo Biscogniauxia mediterranea e o cancro do sobreiro causada pelo fungo Diplodia corticola. A falta de tratamento específico para ambas as doenças e a proibição progressiva de fungicidas químicos na UE exigem novas e inovadoras alternativas. Neste contexto, fungicidas baseados em RNA de interferência (RNAi) são uma estratégia promissora. A técnica Spray-induce gene silencing (SIGS) é uma abordagem de silenciamento por RNAi de última geração que tem como alvo, genes específicos do patógeno, após a pulverização da planta hospedeira com uma solução que contém RNA de cadeia dupla (dsRNA). Neste trabalho, foi explorada a possibilidade de utilização desta abordagem para o controlo de ambos os agentes patógenos do sobreiro. Para o sucesso desta solução biotecnológica, o agente patogénico precisa captar moléculas de dsRNA e processá-las para que possa silenciar os genes alvo. Os resultados in silico revelaram que tanto B. mediterranea quanto D. corticola contêm a maquinaria proteica necessária para captar e processar dsRNA exógeno. Este resultado foi corroborado testando a capacidade de ambos os fungos em captar um sGFT dsRNA marcado com fluorescência. Assim como um ensaio in vitro com transformantes sGFP dos fungos em estudo para testar a maquinaria de silenciamento. As moléculas de dsRNAs foram desenvolvidas e testadas para a sua capacidade de provocar uma deficiência no crescimento fúngico. Os resultados demonstraram efeito das moléculas em ambos os patógenos do sobreiro. Contudo, B. mediterranea parece ser mais recalcitrante ao uso de uma abordagem SIGS do que D. corticola. Este trabalho forneceu evidências do potencial do SIGS no controlo de agentes patogénicos do sobreiro, particularmente D. corticola.