Utilize este identificador para referenciar este registo:
https://hdl.handle.net/1822/82609
Título: | Development of a cellular ataxin-3 protein-protein interaction (PPI) assay for high-throughput screening of PPI modifiers |
Outro(s) título(s): | Desenvolvimento de um sistema celular para deteção de interações proteína-proteína (IPPs) com a ataxina-3 e descoberta de moduladores destas IPPs |
Autor(es): | Fernandes, Ana Rita Ferreira |
Orientador(es): | Almeida, Bruno Maciel, P. |
Palavras-chave: | Ataxina-3 Doença de Machado-Joseph Interações proteína-proteína Sistema da GFP tripartida Ataxin-3 Machado-Joseph disease Protein-protein interactions Tripartite split-GFP system |
Data: | 19-Dez-2022 |
Resumo(s): | A doença de Machado-Joseph (DMJ) é uma doença neurodegenerativa provocada pela expansão
de um trato de poliglutamina na proteína ataxina-3 (ATXN3). Evidências suportam a presença nuclear da
ATXN3 como crucial para a patogénese da doença. No entanto, os mecanismos pelos quais provoca
toxicidade no núcleo das células neuronais são desconhecidos. Uma vez que estudos recentes sugerem
que a proteína desempenha papéis fisiológicos importantes no núcleo de células neuronais ao interagir
com diferentes proteínas, surge a hipótese de que a ATXN3 expandida interage anormalmente com
diferentes proteínas nesse compartimento, e de que essas interações interrompem vias celulares,
contribuindo significativamente para a toxicidade neuronal. Tendo em conta esta informação, com este
trabalho pretendeu-se desenvolver e otimizar o sistema da GFP (Proteína Verde Fluorescente, do inglês
Green Fluorescent Protein) tripartida in vivo, que foi utilizado para validar uma interação proteína-proteína
(IPP) nuclear relevante com a ATXN3, nomeadamente com o fator de splicing 9G8, uma vez que se
observou que o seu padrão de ubiquitilação é alterado quando a expressão da ATXN3 é silenciada. A
clonagem dos vetores necessários para o desenvolvimento do sistema foi baseada na técnica de
clonagem de Gibson, sendo a ATXN3 e os interatores selecionados construídos em fusão com dois
fragmentos da GFP, GFP10 e GFP11. Após interação, esses fragmentos aproximam-se e ligam de forma
espontânea ao fragmento GFP1-9, expresso numa linha celular de mamífero previamente gerada, e é
emitida fluorescência. O sistema foi validado com controlos positivos e negativos adequados por
citometria de fluxo, imunofluorescência, e microscopia de fluorescência, seguida de coloração nuclear
com DAPI (4',6'-diamino-2-fenil-indol). As mesmas técnicasvalidaram a interação ATXN3-9G8, reforçando
o interesse no estudo de 9G8 na patogénese da DMJ e como potencial candidato para o rastreio de
compostos terapêuticos. Uma mutação no sinal de localização nuclear da ATXN3 não impediu a sua
interação nuclear com a 9G8, sugerindo que a ATXN3 consegue ser transportada independentemente
deste sinal. Este sistema constitui uma ferramenta valiosa para detetar IPPs, estudar a sua localização
subcelular, e identificar novos alvos terapêuticos, assim como moduladores promissores de IPPs
relevantes por rastreio, que podem contribuir para o desenvolvimento de uma futura terapia para a DMJ.
Além disso, este sistema pode ser uma ferramenta promissora para outros estudos, nomeadamente o
estudo in vivo da oligomerização, fibrilação, acumulação, e formação de agregados proteicos de ATXN3. Machado-Joseph disease (MJD) is a neurodegenerative disorder caused by expansion of a polyglutamine tract within the protein ataxin-3 (ATXN3). Evidence supports the nuclear presence of ATXN3 as key for pathogenesis. However, the mechanisms through which it promotes toxicity in neuronal cell nucleus remain mostly unknown. Since recent data suggests that the protein may play important physiological roles in the nucleus of neuronal cells through the interaction with several partners, we hypothesized that mutant ATXN3 interacts abnormally with different proteins in that compartment, and that those interactions disrupt cellular pathways, contributing significantly to their neuronal toxicity. Therefore, with this work we aimed to develop and optimize the tripartite split-GFP (triSFP) system in vivo, that was used to validate a relevant nuclear ATXN3 protein-protein interaction (PPI), namely with the splicing factor 9G8, as it was observed that its ubiquitylating pattern is altered when the expression of ATXN3 is silenced. Vector design and cloning necessary for the development of the triSFP system were based on Gibson Cloning technique, and ATXN3 and the selected interactors were successfully built in frame with GFP10 and GFP11 subunits. Upon interaction, these subunits get tethered and spontaneously assemble with the GFP1-9 subunits, expressed in a previously obtained mammalian cell line, to emit fluorescence. The triSFP system was validated with adequate positive and negative controls by flow cytometry, immunofluorescence, and fluorescence microscopy, followed by DAPI nuclear staining. The same techniques validated the ATXN3-9G8 candidate interaction, reinforcing the interest in the study of 9G8 in MJD pathogenesis and as a potential candidate for drug screening. A mutation at Nuclear Localization Signal (NLS) of ATXN3 did not avoid nuclear interaction between ATXN3 and 9G8, suggesting that ATXN3 is able to enter the nucleus in the absence of NLS recognition. This system constitutes a valuable tool to detect PPIs, to study their subcellular localization, and to identify novel therapeutic targets and promising modulators of relevant PPIs by high throughput screening assays, that might constitute lead molecules for future MJD therapy. Furthermore, this system can be a promising tool to other studies, namely the in vivo study of protein oligomerization, fibrilization, accumulation and ATXN3 aggregate formation. |
Tipo: | Dissertação de mestrado |
Descrição: | Dissertação de mestrado em Ciências da Saúde |
URI: | https://hdl.handle.net/1822/82609 |
Acesso: | Acesso aberto |
Aparece nas coleções: | BUM - Dissertações de Mestrado |
Ficheiros deste registo:
Ficheiro | Descrição | Tamanho | Formato | |
---|---|---|---|---|
Ana Rita Ferreira Fernandes.pdf | 30,01 MB | Adobe PDF | Ver/Abrir |
Este trabalho está licenciado sob uma Licença Creative Commons