Lung fibrosis regulation by c-Met-expressing immune cells

Abstract

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a rapid debilitating lung disease, the most common and lethal form of interstitial lung diseases, which causes remain unknown. Currently, there is no medical therapy capable of reverse the disease progression. This disease comprises a chronic inflammation, where neutrophil-derived proteases have been described as key mediators of tissue damage and consequently decline of lung function. Recently, it was demonstrated that hepatocyte growth factor receptor (c-Met) expression is required for neutrophils’ extravasation to inflamed tumors, through inflammatory stimuli. Accordingly, we hypothesized that inflammatory cells recruitment, as neutrophils, is attenuated during pulmonary fibrosis in mice with c-Met-deleted immune cells, with subsequent decline of fibrosis progression and lung function preservation. In this way, the purpose of this thesis was to understand the role of c-Met expression in immune cells in the pathogenesis of pulmonary fibrosis and associated-inflammation. To answer this, bleomycin (BLM)-induced lung fibrosis model was used in c-Met fl/fl/Tie2:Cre-positive transgenic (TG) mice, in which c-Met-floxed gene is excised from hematopoietic and endothelial cells. Survival analysis was performed until day 21 after BLM administration, in which TG mice exhibited increased survival and less weight loss compared to wild-type (WT). Next, lung fibrosis extent was determined 14 days after administration on Masson’s trichrome stained lung sections. TG mice presented significantly reduced fibrotic score, characterized by reduced alveolar destruction and extracellular matrix deposition. Moreover, using hydroxyproline assay, collagen levels were diminished in TG mice lungs, in accordance with the significant decrease of collagen (Col1a1 and Col1a2), as well as a fibroblast marker (S100a4) and a profibrotic factor (Igf-1) transcript’ levels. At day 7 after administration, tissue cytotoxicity, assessed by lactate dehydrogenase assay, was reduced in TG mice. This comes in agreement with reduction of inflammatory cells recruitment, specifically neutrophils and inflammatory macrophages, evaluated by flow cytometry. Moreover, TG mice presented an increase in transcript’ levels of proinflammatory cytokines (Tnf-α, IL-1β, IL-6 and iNos). Taken together, our findings propose that c-Met deletion in immune cells attenuates pulmonary fibrosis progression, probably due to reduction of inflammatory cells, specifically neutrophils and inflammatory macrophages, in injured lung and consequent decrease in the production of profibrotic factors, as Igf-1.

A fibrose pulmonar idiopática (IPF) é uma doença pulmonar debilitante e rápida, sendo a forma mais comum e letal de doenças pulmonares intersticiais, cujas causas permanecem desconhecidas. Atualmente, não há terapia médica capaz de reverter a progressão da doença. Esta doença compreende uma inflamação crónica, na qual as proteases derivadas de neutrófilos foram descritas como mediadores chave do dano tecidular e, consequentemente, declínio da função pulmonar. Recentemente, foi demonstrado que a expressão do recetor do fator de crescimento de hepatócitos (c-Met) é necessária para o extravasamento de neutrófilos para tumores inflamados, aquando dos estímulos inflamatórios. Nesse sentido, hipotetizamos que o recrutamento de célulasinflamatórias, como neutrófilos, está atenuado durante a fibrose pulmonar em ratinhos com deleção de c-Met em células hematopoiéticas e endoteliais, com subsequente diminuição do processo fibrótico e função pulmonar preservada. Desta forma, o objetivo desta tese foi compreender o papel da expressão de c-Met em células imunes na patogénese da fibrose pulmonar e inflamação associada. Para responder a isso, o modelo de fibrose pulmonar induzido por bleomicina (BLM) foi usado em ratinhos transgénicos (TG) c-Met fl/fl/Tie2:Cre-positiva, nos quais o gene c-Met é deletado em células hematopoiéticas e endoteliais. A análise de sobrevivência foi realizada até ao dia 21 após a administração de BLM, os ratinhos TG exibiram maior sobrevivência e menor perda de peso em comparação com o tipo selvagem (WT). Em seguida, a extensão da fibrose pulmonar foi determinada 14 dias após a administração, em secções de pulmão coradas com tricrómio de Masson. Os ratinhos TG apresentaram classificação fibrótica pulmonar significativamente reduzida, caracterizados pela redução da destruição alveolar e deposição de matriz extracelular. Além disso, utilizando o ensaio de hidroxiprolina, os níveis de colagénio estavam reduzidos em ratinhos TG, o que vem de acordo com a diminuição significativa dos níveis de transcritos de colágeno (Col1a1 e Col1a2), bem como de um marcador de fibroblastos (S100a4) e um fator pró-fibrótico (Igf-1). No dia 7 após a administração, a citotoxicidade do tecido, avaliada pelo ensaio da lactato desidrogenase, estava reduzida nos ratinhos TG. Isto está de acordo com a redução do recrutamento de células inflamatórias, especificamente neutrófilos e macrófagos inflamatórios, avaliados por citometria de fluxo. Além disso, os ratinhos TG apresentaram um aumento nos níveis de transcritos de citocinas pró-inflamatórias (Tnf-α, IL-1β, IL-6, iNos). Em conjunto, os nossos resultados sugerem que a deleção de c-Met em células imunes atenua a progressão da fibrose pulmonar, provavelmente devido à redução de células inflamatórias, especificamente neutrófilos e macrófagos inflamatórios, no pulmão lesionado e consequente diminuição da produção de fatores pró-fibróticos, como o Igf-1.