Impact of cofilin-actin rods formation on Parkinson’s Dementia

Abstract

The formation of inclusions of α-Synuclein (α-Syn), named Lewy bodies, is the major hallmark of Parkinson’s disease, where they accumulate mainly in the substantia nigra of the brain triggering the characteristic motor symptoms of the disorder. Additionally, α-Syn accumulation in the hippocampus is associated with the cognitive impairment seen in PD patients which develop dementia. Structures that have been associated with synaptic dysfunction of the hippocampus in diseases presenting cognitive impairment are the cofilin-actin rods. Rods are formed by hyperactivation, by dephosphorylation, of cofilin leading to actin saturation. Preliminary data of our laboratory suggested that rods are formed in response to α-Syn in hippocampal neurons raising the hypothesis of whether these structures underlie cognitive impairment in PD. In this master thesis we aimed to establish a cell-based system of cofilin-actin rod formation in hippocampal neurons in order to study the molecular mechanism underlying their formation. We successfully established the model by lentiviral-mediated overexpression of α-Syn, which recapitulates the high levels of the protein seen in PD cases with dementia. We confirmed cofilin actin rod formation which occurred by α-Syn-mediated decrease in the levels of phospho-cofilin, a mechanism that probably uses Cellular Prion Protein (PrPC ) and NADPH oxidase (NOX). In this respect, increasing the levels of cofilin phosphorylation blocked α-Syn-induced rod formation. Aiming at addressing whether rods are specific to hippocampal neurons we used SH-SY5Y cells, a relevant model to study PD since they resemble dopaminergic neurons. In these cells rod formation was not observed in response either to α-Syn overexpression or to a general inducer of rod formation, what might support cell type specific rod formation. Also using the SH-SY5Y model we tested the neuroprotective effect of modified-analogues of the tripeptide GPE which was previously shown to have a beneficial effect on PD. We observed that the GPE analogues had an improved effect on blocking 6-OHDA-induced neurotoxicity in SH-SY5Y cell and might be tested in the future in the context of α-Syn overexpression and rod formation. In summary, this thesis generated an in vitro system which will be crucial to test the consequences of α-Syn -induced rod formation to neuronal function. Moreover, raised the question of rods being specific to the hippocampus in the context of PD and disclosed new compounds that might used as neuroprotective agents for the disease.

A formação de inclusões de α-sinucleína (α-Sin), denominados corpos de Lewy, são características da Doença de Parkinson (DP), onde se acumulam principalmente na substantia nigra do cérebro, desencadeando os sintomas motores característicos da doença. Além disso, a presença de α- Sin no hipocampo está associada à disfunção cognitiva observada em pacientes com DP que desenvolvem demência. Estruturas que têm sido associadas à disfunção sináptica do hipocampo em doenças que apresentam disfunção cognitiva são os rods de cofilina-actina. Os rods são formados por hiperativação, desfosforilação de cofilina levando à saturação de actina. Dados preliminares de nosso laboratório sugeriram que os rods são formados em resposta à α Sin nos neurônios do hipocampo, levantando a hipótese de que essas estruturas estão subjacentes à disfunção cognitiva na DP. Nesta dissertação de mestrado, objetivamos estabelecer um sistema in vitro de formação de rods de cofilina-actina em neurônios do hipocampo, a fim de estudar o mecanismo molecular subjacente à sua formação. Estabelecemos com sucesso o modelo de sobreexpressão de α-Sin mediada por lentivírus, que recapitula os altos níveis da proteína observada em casos de DP com demência. Confirmamos que a formação dos rods de cofilina-actina é induzida por α-Sin, levando a uma diminuição nos níveis de fosfo-cofilina, sendo este um mecanismo que provavelmente usa a proteína priónica celular (PrPC ) e NADPH oxidase (NOX). A este respeito, o aumento dos níveis de fosforilação de cofilina bloqueou a formação de rods induzida por α-Sin. Com o objetivo de abordar se os rods são específicos para os neurônios do hipocampo, usamos células SH-SY5Y, um modelo relevante para o estudo da DP, pois se assemelham a neurônios dopaminérgicos. Nessas células, a formação de rods não foi observada em resposta à sobreexpressão de α-Sin ou a um indutor geral de formação de rods, o que pode apoiar que a formação de rods é específica do tipo de célula. Também usando o modelo SH-SY5Y, testamos o efeito neuroprotetor de análogos do tripéptido GPE, que anteriormente demonstrou ter um efeito benéfico na DP. Observamos que os análogos do GPE tiveram um efeito significativo no bloqueio da neurotoxicidade induzida por 6- OHDA nas células SH-SY5Y e podem ser testados no futuro no contexto de sobreexpressão de α Sin e formação de rods. Em suma, esta tese gerou um sistema in vitro que será crucial para testar as consequências da formação de rods induzida por α-Sin na função neuronal. Além disso, levantou a questão de a formação de rods possa ser específica no hipocampo no contexto da DP e demonstrou novos compostos que poderiam ser usados como agentes neuroprotetores para a doença.