Development and optimisation of a novel method for multi-site-directed mutagenesis

Abstract

A mutagénese dirigida é um processo de alteração de um ou mais nucleótidos numa molécula de ADN de forma criteriosa e não aleatória. A introdução de múltiplas mutações no ADN é feita frequentemente através da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) de modo a dar origem a fragmentos que contêm as mutações desejadas. Estes fragmentos podem ser usados para construir um plasmídeo in vitro através da adição de misturas enzimáticas baseadas em ligases ou recombinases. Para a construção de plasmídeos in vivo é possível utilizar estirpes de clonagem de Escherichia coli graças aos seus mecanismos de recombinação genética inerentes, sendo por isso desnecessário a utilização de misturas enzimáticas. Atualmente, protocolos que introduzem várias mutações simultaneamente requerem misturas enzimáticas dispendiosas ou vários passos morosos. Neste trabalho foi desenvolvido e otimizado um novo protocolo com vista a facilitar a introdução de várias mutações simultaneamente de forma rápida e económica. Estudos iniciais, acompanhados de uma análise da literatura atual, identificaram o tipo de polimerase, competência das células, quantidade de ADN em PCR, extensão de homologias e rácios de fragmento maior para mais pequenos como possíveis fatores importantes para garantir uma elevada eficiência do protocolo de recombinação genética in vivo em E. coli. O estudo foi feito utilizando um modelo de superfície de resposta, complementado por um central composite design para otimizar o processo, minimizar o número de experiências e maximizar informação para o modelo matemático. As variáveis e modelos obtidos foram submetidos a uma ANOVA para avaliar a sua significância estatística. Para todas as experiências, foram usadas estirpes de clonagem de E. coli, apresentando uma competência mínima de 107 . Os resultados mostraram compatibilidade com vários modelos matemáticos, dos quais foi adotado o modelo quadrático (p = 0.0148). Todas as variáveis testadas (conteúdo de ADN, homologia, rácio vetor para inserto) foram avaliadas como significativas, porém, não foi identificada interação entre elas. As condições ótimas previstas para recombinação genética foram testadas e confirmadas usando 0.1 ng de ADN, homologias de 52 nucleótidos e um rácio de 1 para 10, para o qual foi obtida uma eficiência de 97%. O protocolo de mutagénese múltipla dirigida desenvolvido e otimizado neste trabalho oferece eficiências superiores a protocolos atuais, sendo ao mesmo tempo mais económico e simples de efetuar.

Multi-site-directed mutagenesis is a powerful tool used to alter several target nucleic acids within a DNA molecule simultaneously. Mutations are generally introduced through a polymerase chain reaction (PCR), producing mutagenic fragments that are assembled into a construct in vitro by use of conventional ligase-based or recombination-based enzyme mixtures. Current multi-site-directed mutagenesis protocols are characterised by high costs and/or laborious processes, requiring expensive enzymes and/or multiple steps. Interestingly, many common Escherichia coli cloning strains are capable of carrying out in vivo recombination, albeit at low frequencies, and were investigated and optimised in the present study for use in a cost-effective multi-site-directed mutagenesis protocol. Initial studies indicated that the type of polymerase, the cell competence, and process variables such as the PCR template concentration, length of homologous regions and ratio of fragments, to be critical for success of mutagenesis via in vivo recombination in E. coli. Response surface methodology with central composite design was used to optimise process variables, identify interactions and determine the protocol enabling highest multi-site-directed mutagenesis efficiency. Use of this mathematical and statistical approach enabled experimental design with minimisation of the number of experiments and maximisation of the information obtained, and allowed for data set analysis with development of statistical previsions based on this. Statistical analysis of variables and obtained models was performed via ANOVA. Experimental data showed compatibility with several models, of which a quadratic model with a p value of 0.0148 was adopted. All tested variables: template amount, homology length and vector to insert ratio, were identified as significant, while interactions between these factors were not. Predicted optimal conditions were confirmed by using 0.1 ng template in the PCR reaction, a homology length of 52 base pairs, a large fragment to small fragment ratio of 1:10, and highly competent cells (≥107 cfu/µg), producing an efficiency of 97%. The hereby developed multi-site-directed mutagenesis protocol requires only three steps (PCR amplification, DpnI digestion and transformation) and represents an easy and simple alternative to current protocols without compromising efficiency.