Embryonic T-box transcription factor Brachyury as a predictive biomarker and therapeutic target in prostate and lung cancers

Abstract

Brachyury has been recognized for its role in several cancers, such as prostate cancer (PCa) and lung cancer (LC), among others, due to its oncogenic properties such as EMT induction, stem properties, metastasis and poor prognosis, as well as resistance to therapy in both models. However, the molecular mechanisms through which this protein acts in cancer are not completely elucidated. In this work we intended to dissect the biological role of Brachyury in LC, study the predictive value of this transcription factor in antiandrogen therapies and EGFR-TKIs respectively in PCa and LC, and finally explore therapeutic strategies for Brachyury targeting, including the usage of drug delivery systems (DDS). To accomplish that, we modulated the expression of Brachyury in two PCa and LC cell lines and performed in vitro biological assays, assessed by western blot and qRT-PCR the expression of a number of molecules associated with Brachyury, and evaluated its impact on the modulation of cells response to antiandrogen therapies and EGFR-TKIs. Finally, we assessed the specificity of afatinib and THZ1 drugs at targeting Brachyury expression, and proceeded to develop zeolite and mesoporous silica-based DDS. Overall, in our PCa models we observed some results consistent with an induction of an EMT partial state and upregulated levels of AR upon Brachyury overexpression (OE), however with no effects in antiandrogenic therapies response. Concerning LC, we evidenced the oncogenic role of Brachyury in this malignancy through the increased cell viability, migration and colonies formation. Then again, we were able to note changes characteristics of EMT partial states as well as an increase in stemness markers. Importantly, upon Brachyury OE we found that the H292 cell line became more insensitive to the EGFR inhibitor, AST1306 (allitinib), that might possibly be due to an overactivation of the AKT pathway. Finally, we proved that afatinib and THZ1 are able to inhibit Brachyury expression in PCa and LC, and successfully developed DDS using these drugs. Thus, we conclude that Brachyury might have potential as a predictive biomarker to EGFR targeted therapies in LC, but not to antiandrogens therapies in PCa. Furthermore, our results suggest that afatinib and THZ1 can be used to target Brachyury and potentially revert the oncogenic Brachyury-associated phenotype.

A Brachyury tem sido reconhecida pelo seu papel em várias neoplasias, tais como cancro da próstata (CPa) e pulmão (CP), entre outros, devido às suas propriedades oncogénicas como por exemplo, a indução da EMT, propriedades estaminais, metastização e mau prognóstico, assim como resistência à terapia em ambos os modelos. Todavia, os mecanismos moleculares através dos quais esta proteína atua no cancro não estão completamente elucidados. Deste modo, os objetivos fundamentais deste trabalho consistiam em elucidar o papel biológico de Brachyury em CP, estudar o seu valor preditivo na resposta a terapias antiandrógenas e a inibidores de EGFR em CPa e CP, respetivamente, bem como explorar estratégias terapêuticas anti-Brachyury. Assim, modulámos a expressão de Brachyury em linhas celulares de CPa e LC, e avaliámos o seu efeito no comportamento biológico das células, na expressão de várias moléculas já associadas com Brachyury, e na modulação da resposta das células a terapias dirigidas a AR e EGFR. Por fim, avaliámos a especificidade dos fármacos afatinib e THZ1 na modulação da Brachyury, assim como desenvolvemos ainda drug delivery systems (DDS) baseados em estruturas zeolíticas e sílica mesoporosa com estes fármacos. Em CPa foi possível observar alguns resultados consistentes com uma indução de EMT parcial e uma expressão aumentada de AR após a sobre-expressão da Brachyury, no entanto, isto não se refletiu na resposta a terapias antiandrógenas. Em relação ao CP, foi possível evidenciar o seu papel oncogénico, considerando o notório aumento de viabilidade celular, migração e formação de colónias, após a sua sobre-expressão. Foram ainda observadas alterações características de uma indução de EMT parcial e um aumento em marcadores de pluripotência. É ainda importante salientar que após a sobre-expressão da Brachyury foi verificada uma menor sensibilidade ao inibidor de EGFR AST1306, na linha celular H292, que poderá ser explicada por uma sobre-activação da via AKT. Por último, demonstrarmos que os fármacos afatinib e THZ1 inibem a expressão de Brachyury em ambos os modelos, e podem ser usados em DDS. Desta forma, concluímos que a Brachyury poderá potencialmente ser uma biomarcadora preditiva em CP, mas não em CPa. Adicionalmente, sugerimos os fármacos afatinib e THZ1 como bons candidatos para reverter o fenótipo maligno induzido pela Brachyury em cancro.