Engineering Pseudomonas aeruginosa strains towards the production of novel and effective rhamnolipids for use as biocontrol agents

Abstract

A necessidade de substituir os fungicidas químicos por alternativas mais amigas do ambiente, como por exemplo os ramnolípidos, tem vindo a aumentar nos últimos anos. O desenvolvimento de um processo biotecnológico de baixo custo para a sua produção tem sido um desafio. Por este motivo, o principal objetivo desta tese foi desenvolver uma estirpe de Pseudomonas aeruginosa para a produção mais eficiente de ramnolípidos como agentes biológicos. Para desenvolver um meio de cultura mais adequado e barato, foram testados três diferentes resíduos agrícolas para otimizar a produção de ramnolípidos pela estirpe P. aeruginosa. O meio de cultura com licor de maceração de milho (10%, v/v), melaço (10%, w/v) e águas russas (25%, v/v) mostrou-se o melhor meio de cultura com uma produção de 4.5 e 5.1 g/L em matraz e reator, respetivamente. A atividade antifúngica e anti-micotoxigénico dos ramnolípidos foram avaliadas contra diferentes espécies de Aspergillus. Os ramnolípidos demonstraram uma elevada atividade antifúngica contra as estirpes Aspergillus niger e Aspergillus carbonarius. Em relação à estirpe Aspergillus flavus, os ramnolípidos apresentaram a capacidade de destruir o conteúdo intracelular das hifas bem como de inibir a produção de aflatoxinas influenciando a expressão dos genes envolvidos na sua síntese. Além disso, foi demonstrado que a atividade antifúngica se deve ao congênere di-ramnolípido e que a atividade dos ramnolípidos purificados se encontra diretamente relacionada com o seu comportamento de agregação. De acordo com os resultados anteriores, a estirpe P. aeruginosa foi geneticamente manipulada com diferentes plasmídeos recombinantes contendo o gene rhlC com o intuito de aumentar a produção de di-ramnolípidos, tendo-se obtido resultados muito promissores. Em suma, os resultados obtidos nesta tese revelaram-se muito interessantes tendo em conta o potencial uso de ramnolípidos como agentes antifúngicos e anti-micotoxigénico, fornecendo ainda informações importantes para o desenvolvimento de uma produção mais eficiente e adequada de ramnolípidos à escala industrial.

The demand for “green” compounds, such as rhamnolipids, to replace the chemical fungicides has been growing over the years due to the increasing concern with environmental problems. The development of an efficient bioprocess to produce rhamnolipids, as well as to reduce their production costs has been a challenge. Motivated by this need, the main purpose of this thesis was to engineering Pseudomonas aeruginosa towards the production of a novel and effective rhamnolipids production for use as biocontrol agent. In order to develop an inexpensive and suitable culture medium, the rhamnolipids production by P. aeruginosa was performed using three different agro-residues. The most promising results were found using corn steep liquor (CSL) (10%, v/v), molasses (M) (10% w/v) and olive oil mill wastewater (OMW) (25%, w/v). Using this medium, P. aeruginosa produced 4.5 and 5.1 g/L of rhamnolipids per liter in flasks and reactor, respectively. The rhamnolipids produced by P. aeruginosa were then evaluated against different Aspergillus species to evaluate their antifungal and anti-mycotoxigenic activity. The rhamnolipids showed a high antifungal activity against the strains Aspergillus niger and Aspergillus carbonarius. Moreover, they were able to damage the hyphae internal content and inhibit the expression of some genes involved in the aflatoxins biosynthesis from Aspergillus flavus, thus resulting in a complete inhibition of the aflatoxin production. Furthermore, it was demonstrated that the di-rhamnolipids congeners were responsible for the antifungal activity and that the antifungal activity of the purified rhamnolipids is directly related with their aggregation behavior. According to the previous results, P. aeruginosa strain was engineered with the recombinant plasmids containing the rhlC gene to enhance the di-rhamnolipid production and the results obtained were very promising. Overall, the results gathered in this thesis were found to be very interesting based on the rhamnolipids potential as antifungal and anti-mycotoxigenic agents, providing important insights for the development of a suitable and more efficient rhamnolipids production at an industrial scale.