Development of vascularizable hydrogels to promote spinal cord injury repair: from RGD to mimetic ligands

Abstract

A major contributor for the severe deficits spinal cord injury (SCI) patients face lies on the disruption of the blood-spinal cord barrier (BSCB), and consequent deficient angiogenic response. Therefore, during this PhD thesis we proposed to develop vascularizable cell transplantation vehicles based on modified gellan gum (GG) hydrogels aiming to promote SCI repair. We started by understanding whether human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were able to assemble into vascular-like constructs when cultured on in-house GRGDS-modified GG (GG-GRGDS). HUVECs only developed stable vascular-like constructs in the presence of adipose-derived stem cells (ASCs). Moreover, the co-culture secretome had an enrichment on defined neurotrophic factors in comparison to the individual culture of both types of cells. We also observed a significant promotion on axonal growth in comparison to the hydrogels without cells. The next part of the work involved the modification of GG with two integrin-specific ligands (against αvβ3 and α5β1) to improve the bioactivity of the polymer. Cell adhesion studies showed that the αvβ3 mimetic promoted significant adhesion of ASCs to the matrix in comparison to RGD and the other mimetic ligand. This was even more evident for the formulation modified using a GG:ligand ratio of 10:1 (GGp10αv). Despite integrin specificity, it were only observed vascular-like structures only when HUVECs were co-cultured with ASCs. The axonal growth experiments did not reveal a statistical increase when comparing the co-culture with the hydrogel alone. Finally, the in vivo evaluation of both in-house GG-GRGDS and GGp10αv on a T8 transection model of SCI showed statistically significant motor improvements for GGp10αv encapsulating ASCs+HUVECs in comparison to lesioned animals. Furthermore, both GG-GRGDS and GGp10αv (with and without cells) lead to significant gains of sensation 8 weeks after SCI. It was also observed that during the acute phase of SCI GGp10αv+cells promoted a marked decrease on pro-inflammatory cytokines such as IL-1 α, IL-1 β, TNF-α and MCP-1 that are associated with the exacerbation of damage following SCI. On the other hand, IL-10 and IL-4, which are more connected to a pro-regenerative inflammation, were augmented relative to injured animals. Even though the histological and proteomic characterization of the tissue is still lacking, these indications point out towards a neuroprotective effect of GGp10αv+cells on injured tissue.

Um dos principais contribuintes para os défices observados em pacientes com lesões medulares é a disrupção da componente medular da barreira hematoencefálica, e consequente resposta angiogénica defetiva. Assim, nesta tese propusemos o desenvolvimento de veículos de transplantação celular vascularizáveis baseados em hidrogéis de goma gelano modificado, com o pressuposto de promover a recuperação depois de lesão medular. Começámos por entender se células endoteliais do cordão umbilical (HUVECs) se organizavam em estruturas vasculares quando encapsuladas em GG modificado com GRGDS. Observámos que as HUVECs apenas apresentaram este fenótipo quando encapsuladas em co-cultura com células estaminais derivadas de tecido adipose (ASCs). A análise do secretoma da co-cultura mostrou um enriquecimento em factores neurotróficos definidos em comparação com a cultura isolada de ambas as células. Também se observou uma promoção significativa no crescimento axonal em comparação com os hidrogéis sem células. A próxima parte do trabalho envolveu a modificação de GG com dois ligandos específicos para integrinas (αvβ3 e α5β1) de modo a melhor a bioatividade do polímero. Estudos de adesão cellular mostraram que o mimético para αvβ3 promoveu adesão significativa de ASCs em comparação com o RGD e o outro ligando mimético. Isto foi ainda mais evidente para a formulação que usou um rácio GG:ligando de 1:10 (GGp10αv). Apesar da elevada especificidade, só se observaram estruturas vasculares quando as ASCs estavam em co-cultura com as HUVECs. As experiências de crescimento axonal não revelaram aumentos estatísticos quando comparando a co-cultura com hidrogel sem células. Finalmente, a avaliação in vivo da co-cultura em GGp10αv, num modelo de transecção em T8, levou a melhorias motoras significativas em comparação ao grupo lesionado. Além disso, tanto o GG-GRGDS como o GGp10αv promoveram ganhos sensoriais significativos às 8 semanas. Durante a fase aguda da condição o GGp10αv+células promoveu uma diminuição de citocinas pro-inflamatórias como IL-1 α, IL-1β, TNF-α e MCP-1. Por outro lado, citocinas ligadas a uma resposta inflamatória mais regenerativa como IL-10 e IL-4 estavam aumentadas em comparação com animais lesionados. Apesar de a caracterização histológica e proteómica do tecido estar em falta, estas indicações apontam para um efeito neuroprotetor promovido pela condição experimental GGp10αv+células no tecido medular lesionado.