The role of vacuolar membrane proteins in acetic acid-induced cell death

Abstract

Saccharomyces cerevisiae has been one of the most widely used model organism for understanding the molecular mechanisms underlying apoptosis. Apoptosis is a form of regulated cell death that can be triggered by a wide variety of external or internal stimuli, such as acetic acid (AA). This acid triggers, in the yeast, a cascade of intracellular apoptotic-like events, both at mitochondria and vacuole level. A similar process occurs during acetate-induced apoptosis in colorectal cancer (CRC) cells. Although not much is known about the role of vacuole/lysosome, their membrane permeabilization (VMP/LMP) appears to be crucial in the regulated cell death process triggered by AA/acetate. Herein, we aimed to assess the involvement of different vacuolar membrane proteins in AA-induced apoptosis, as well as to evaluate their putative role in VMP and translocation of the protease Pep4p from the vacuole to the cytosol. To this end, a functional genetic approach based on a set of mutants lacking the vacuolar membrane proteins Csc1p, Pep3p, Vma4p, Vma16p, Vtc4p and Zrt3p, together with biochemical and analytical techniques, were used. We found that absence of Zrt3p, Vtc4p, Csc1p and Vma4p render cells more resistant to AA. The resistant phenotype of csc1Δ and vtc4Δ mutants was associated with a delayed VMP and release of Pep4p to the cytosol, as previously shown for the zrt3Δ mutant. Altogether, these results indicate that these three proteins or their associated cellular functions, such as their contribution to the intracellular levels of zinc, calcium and polyphosphate, determine cell survival in response to AA. Particularly, and corroborating the involvement of zinc, we found that zinc availability influences survival of cells undergoing AA-induced cell death, reducing or enhancing cell survival under zinc limitation or supplementation, respectively. The levels of intracellular calcium also appear to play a role in AA-induced cell death, as suggested by Ca2+ lower levels in csc1Δ cells after AA treatment. While deletion of VMA16 does not affect cell survival in response to AA, PEP3 and VMA4 deletions do affect. However, further studies are required to characterize the phenotypes of these deletion mutants. In summary, this study allowed to unveil molecular components/cellular processes involved in AA-induced cell death, contributing to the elucidation of the underlying mechanisms and their modulation towards the improvement of yeast industrial strains and the design of a non-conventional therapy for CRC.

A levedura Saccharomyces cerevisiae tem sido um dos organismos modelo mais utilizados para elucidar os mecanismos subjacentes à apoptose. A apoptose é uma forma de morte celular regulada, que pode ser desencadeada por vários estímulos, como por exemplo o ácido acético (AA). Este ácido desencadeia, na levedura, uma cascata de eventos intracelulares a nível mitocondrial e vacuolar. Um processo semelhante ocorre na apoptose induzida por acetato em células do cancro colorretal (CCR). Embora pouco se saiba sobre o papel da permeabilização seletiva da membrana do vacúolo/lisossoma (PMV/PML), esta parece ser crucial na morte celular induzida por AA/acetato. Neste trabalho, pretendemos avaliar o envolvimento de diferentes proteínas da membrana vacuolar na apoptose induzida por AA, bem como avaliar o seu papel na PMV e na translocação da protease Pep4p do vacúolo para o citosol. Para tal, foi utilizada uma abordagem de genética funcional baseada na utilização de mutantes deficientes nas proteínas Zrt3p, Pep3p, Csc1p, Vtc4p, Vma4p e Vma16p, assim como métodos bioquímicos e analíticos. A ausência das proteínas Zrt3p, Vtc4p, Csc1p e Vma4p torna as células mais resistentes ao AA. O fenótipo de resistência dos mutantes csc1Δ e vtc4Δ foi também associado a um atraso na PMV e na libertação da Pep4p para o citosol, tal como demonstrado anteriormente para o mutante zrt3Δ. Estes resultados indicam que estas proteínas, ou as suas funções celulares, como a regulação dos níveis intracelulares de zinco, cálcio e polifosfato, determinam a sobrevivência celular em resposta ao AA. Relativamente ao zinco, descobrimos que a sua disponibilidade influencia a sobrevivência celular em resposta ao AA, reduzindo-a/aumentando-a em situações de limitação/suplementação de zinco, respetivamente. Os níveis de Ca2+ intracelulares parecem também desempenhar um papel na morte celular, uma vez que se observam baixos níveis de Ca2+ no mutante csc1Δ após tratamento com AA. A deleção do VMA16 não afeta a sobrevivência celular em resposta ao AA, no entanto a deleção do PEP3 e VMA4 afeta. Contudo, são necessários mais estudos para caracterizar os fenótipos destes mutantes. Em suma, identificamos proteínas/processos celulares envolvidos na morte celular induzida por AA, contribuindo para a elucidação dos mecanismos subjacentes e para a sua modulação com vista ao melhoramento de estirpes industriais de leveduras e ao desenvolvimento de terapias não convencionais para o CCR.