Deciphering key roles of WNT6 in glioblastoma: mechanistic, functional, and clinical insights

Abstract

Malignant gliomas are one of the deadliest cancers worldwide, for which no curative treatment is yet available. Patients with glioblastoma (GBM), the most frequent and malignant form of glioma, present a median overall survival of approximately 15 months after diagnosis. This is mainly due to the poor and unpredictable response to the standard-of-care therapy that includes radio- and chemotherapy, after surgical resection. To improve the clinical management of these patients, several efforts are being made to molecularly characterize gliomas, which would allow to improve patients’ stratification, develop targeted therapies and thus improve patients’ clinical outcome. However, the mechanisms underlying glioma pathophysiology are still underexplored, hampering the identification of new therapeutic targets. Alterations in signaling pathways required to preserve the embryonic determination may play an important role in the tumorigenic process. The WNT pathway has been described to influence nearly all aspects of embryonic development, from a single cell – establishing its polarity – to an organism – specifying the entire body axis. At the cellular level, the WNT pathway regulates cell motility, apoptosis and their capacity to self-renew. In adults, the WNT pathway is responsible for tissue homeostasis, which might explain why its aberrant activation has been reported in several tumor types, including GBM. In tumor cells, the WNT pathway has been implicated in tumor initiation, growth, invasion, metastasis, immune evasion, stem cell capacity, and therapy resistance. In humans, there are 19 WNT ligands capable of activating the WNT pathway and with nearly unique roles in development. Among them, WNT6 was recently associated with chemoresistance in gastric and bladder cancers, poor prognosis of esophageal squamous cell carcinoma and osteosarcoma patients, and increased risk to develop colorectal adenoma. However, nothing was known about the relevance of WNT6 in gliomas. This thesis aimed to unveil the relevance of WNT6 in GBM, particularly focusing on the mechanisms regulating its expression, its downstream effector signaling pathways, and its clinical significance in GBM patients. We demonstrated that WNT6 is significantly overexpressed in GBM when compared to lower-grade gliomas, independently of IDH mutations and 1p/19q co-deletion status, and in a gene-dosage independent manner. Moreover, WNT6 expression was associated with increased GBM cell viability, proliferation, invasion, migration, glioma stem cell capacity, and resistance to temozolomidebased chemotherapy, implicating WNT6 as an important oncogenic factor in glioma. Using in vivo intracranial GBM mice models with both WNT6 overexpressing and silencing GBM cell models, we demonstrated that WNT6-high tumors presented increased features of tumor aggressiveness, which was ultimately associated with mice shorter overall survival. Moreover, we identified the WNT/β-catenin, SFK and STAT3 pathways as WNT6-mediated signaling mechanisms in GBM. The association between WNT6 and stem cell markers or key cancer related pathways was also confirmed in GBM patients. Importantly, in GBM patients from several independent datasets, WNT6 was a strong prognostic biomarker of shorter overall survival, independently of other well-known prognostic factors. Since the first step for the design of new targeted therapies requires not only the identification of new molecular targets but also the understanding of their activation mechanisms, we further investigated the potential upstream regulators underlying WNT6 overexpression in glioma. We showed that DNA methylation of specific regions in the WNT6 locus regulates its expression in glioma. Additionally, we observed that HOXA9, an oncogenic transcription factor in GBM, is co-expressed with WNT6 in gliomas. Interestingly, we found that HOXA9 directly binds to the WNT6 promoter region, transcriptionally activating its expression. Thus, WNT6 DNA methylation and HOXA9 are upstream regulators of WNT6 expression in gliomas, creating new hints for innovative therapeutic approaches. In conclusion, the work summarized in this thesis describes WNT6 as a novel critical oncogene in human GBM and identifies its upstream regulators (DNA methylation and HOXA9) and downstream molecular mechanisms (namely WNT, SFK and STAT3 pathways), which may have an impact on prognostic stratification and in the design of novel attractive therapeutic options for this deadly disease.

Os gliomas malignos são um dos cancros mais mortíferos a nível mundial, para os quais não existe ainda um tratamento curativo. Pacientes com glioblastoma (GBM), o tipo de glioma mais maligno e frequente, apresentam uma sobrevida de aproximadamente 15 meses após o diagnóstico. Este facto deve-se maioritariamente à resposta fraca e imprevisível que estes pacientes apresentam quando tratados com a terapia convencional, que inclui radio- e quimioterapia após ressecção cirúrgica do tumor. Ao longo dos últimos anos, têm-se efetuado esforços no sentido de caracterizar molecularmente os gliomas de forma a melhorar a estratificação dos pacientes, desenvolver terapias direcionadas e, deste modo, melhorar o seu tratamento. Contudo, os mecanismos subjacentes à sua fisiopatologia estão ainda pouco explorados, o que impede a identificação de novos alvos terapêuticos. Alterações em vias de sinalização celulares necessárias para a embriogénese poderão ter um papel fundamental no processo tumorigénico. Em específico, a via WNT controla diversos aspetos do desenvolvimento embrionário, desde a definição da polaridade de uma única célula num tecido até à especificação do eixo corporal de um organismo. Ao nível celular, a via WNT regula a motilidade, a apoptose e a capacidade de autorrenovação. Em adultos, a via WNT é responsável pela homeostasia dos tecidos, o que pode explicar o facto da sua ativação aberrante ter sido observada em diversos tipos tumorais, incluindo GBM. Em células tumorais, a via WNT tem vindo a ser associada com a iniciação, o crescimento, a invasão, a metastização, a evasão imune, a capacidade de células estaminais e a resistência à terapia do tumor. Em humanos, existem 19 ligandos da via WNT capazes de a ativar, os quais têm um papel singular no desenvolvimento. Entre estes, o WNT6 foi recentemente associado com a resistência à quimioterapia em cancro do intestino e da bexiga, com o pior prognóstico de pacientes com carcinoma de células escamosas do esôfago e osteossarcoma, e com o risco aumentado para desenvolver adenomas colorretais. Contudo, nada se sabe acerca da relevância do WNT6 em gliomas. Esta tese tem por objetivo desvendar a relevância do WNT6 em GBM, focando particularmente nos mecanismos que regulam a sua expressão, nas vias de sinalização efetoras da sua ação, e na sua significância clínica em pacientes com GBM. Para tal, demonstrou-se que o WNT6 está significativamente sobre-expresso em GBM quando comparado a gliomas de menor grau, independentemente da existência de mutações nos genes IDH ou da co-delecção 1p/19q, e independentemente do número de cópias de ADN. Além disso, a expressão de WNT6 foi associada com o aumento da viabilidade celular, proliferação, invasão, migração, capacidade de células estaminais de glioma e resistência à quimioterapia baseada em temozolomida, estabelecendo o WNT6 como um importante fator oncogénico em glioma. Com recurso a modelos GBM intracraniais em ratinho e usando modelos de células de GBM com expressão de WNT6 diferencial, demonstrou-se que tumores com maior expressão de WNT6 apresentam um aumento de características associadas à agressividade tumoral, sendo observado uma menor sobrevida destes ratinhos. Além disso, identificamos as vias de sinalização WNT/β-catenina, SFK e STAT3 como potenciais mecanismos de sinalização mediados pelo WNT6 em GBM. A associação entre WNT6 e marcadores de células estaminais ou vias relacionadas com cancro foi ainda corroborada em pacientes com GBM. Com recurso a várias bases de dados independentes de pacientes com GBM, mostrou-se que o WNT6 é um forte biomarcador de prognóstico, associado com a menor sobrevida dos pacientes, e independente de outros fatores de prognóstico bem conhecidos. Uma vez que o primeiro passo para o desenho de novas terapias direcionadas requer não só a identificação de novos alvos moleculares, mas também a compreensão dos seus mecanismos de ativação, foram ainda investigados os potenciais mecanismos reguladores responsáveis pelo aumento da expressão do WNT6 em glioma. Por um lado, mostrou-se que a metilação do ADN em regiões específicas do locus do WNT6 regula a sua expressão em glioma. Por outro lado, observou-se que o HOXA9, um fator de transcrição oncogénico em GBM, está co-expresso com o WNT6 em gliomas. De facto, demonstrou-se que o HOXA9 se liga diretamente à região promotora do WNT6, ativando transcripcionalmente a sua expressão. Deste modo, tanto a metilação do ADN ao nível do WNT6 como o HOXA9 são potenciais reguladores da expressão do WNT6 em glioma, e podem assim ser utilizados para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas inovadoras. Em suma, este trabalho descreve o WNT6 como um novo oncogene em GBM humano, identificando alguns dos mecanismos que regulam a sua expressão (a metilação do ADN e o HOXA9), bem como os mecanismos moleculares que são responsáveis pela sua ação (nomeadamente, as vias de sinalização WNT, SFK e STAT3). Deste modo, os resultados obtidos poderão ter um impacto crucial na estratificação prognóstica dos pacientes com GBM, e na conceção de novas opções terapêuticas mais atrativas para esta doença altamente mortífera.