Dissecting Lipocalin-2 as a novel modulator of brain processes

Abstract

The continuous generation of new neurons in the adult mammalian brain comprises one of the most robust forms of neural plasticity occurring during adulthood. Throughout life, and specifically in the dentate gyrus (DG) of the adult mammalian hippocampus, resident neural stem cells (NSCs) give rise to new functional and mature neurons. It is a highly dynamic process, achieved through a stereotypic developmental sequence, controlled by the interplay between neurogenic niche-derived signals and intracellular pathways. New generated neurons will then integrate into the neuronal circuits and fulfill important functions in hippocampal plasticity and function. In fact, it is hypothesized that impaired neurogenesis contributes to the pathophysiology of several neurodegenerative diseases and neuropsychiatric pathologies. As so, the demonstration of an active neurogenic process in the adult brain opens perspectives for central nervous system repair strategies, based on cell replacement therapies. This, in turn, urges the need for the identification of the factors that control NSCs maintenance and neuronal integration for a proper brain functioning. In recent years, the iron-trafficking protein Lipocalin-2 (LCN2) has emerged as an important regulator of brain homeostasis and behaviour, since it controls plasticity in the form of dendritic spine morphology, neuronal excitability and synaptic activity. Also, by binding to its specific cellsurface receptor (24p3R), and by regulating iron cell content, LCN2 serves diverse cellular functions that include cell proliferation, migration and survival, and death. However, it is still poorly recognized the existence of a fine-tuned mediation of intracellular iron by LCN2 for cellular homeostasis in the specific context of the brain. As so, in this thesis, we used a mouse model with the deletion of the Lcn2 gene (LCN2-null mice) to explore its importance in the regulation of brain functioning and cell genesis during adulthood, and dissect the respective molecular underpinnings, both at physiological conditions and after stimulus. In our first study, we characterized the impact of LCN2 absence in the maintenance and survival of NSCs, and how this contributed for the integrity of brain plasticity and function under physiological states. Molecular and cellular analysis in the DG neurogenic niche revealed that LCN2 absence induced deficits in NSCs cell cycle progression, proliferation and commitment, culminating in impaired discriminative behaviour in the contextual fear discrimination task. Specifically, LCN2-null mice presented an accumulation of type-1 NSCs, as the consequence of a G0/G1 cell cycle arrest induced by an iron-mediated increase in endogenous oxidative stress. The additional treatment with the iron-chelating agent deferoxamine rescued NSCs oxidative stress, promoted the progression of NSCs in the cell cycle, and improved contextual discrimination. In this sense, in our second work, we further dissected the impact of LCN2 absence when neurogenesis is externally manipulated. For that, we submitted LCN2-null mice to a chronic protocol of voluntary running, in order to increase hippocampal neurogenesis, while the chronic administration of corticosterone was applied to reduce the generation of new cells in the hippocampus. Analysis of cellular and behavioural outcomes revealed that exercise promoted NSCs proliferation and differentiation in LCN2-null mice, as it increased the proportion of progenitors in cycle and that survived and differentiated into new neurons, thus reducing anxiety and improving contextual discrimination. On the other hand, no effect on cell genesis and behaviour were observed in LCN2- null mice upon stress. The chronic treatment with corticosterone did not render LCN2-null mice a worsen phenotype, as the one observed under physiological conditions. Nevertheless, these results add an important piece of evidence in implicating LCN2 as a mediator of neural brain plasticity and functioning during adulthood, either at physiological conditions or upon stimulation. Moreover, and considering the little information that exists regarding the mechanisms that control the process of aging, along with the descriptions of LCN2’ role in neurodegeneration, herein we characterized the contribution of LCN2 absence on the effects of aging in animal behaviour. Evaluation of anxiety, depressive-like and cognitive behaviours revealed that aging in LCN2-null mice reduced anxiety, while it sustained the depressive-like behaviour and impaired cognition observed at younger ages. These behavioural changes were further accompanied by a significant decrease in cell survival and neuronal differentiation, suggesting hippocampal neurogenesis as the basis for age-related changes in behaviour. All together, our findings contributed to the identification of LCN2 as a novel molecular player in brain neural plasticity. Moreover, it unravels new and unique underlying mechanisms in the process of adult hippocampal neurogenesis, both in the context of the physiological brain, and after a stimulus or in pathology. Also, our results added new and important evidence on the way we understand and perceive the process of adult neurogenesis, shedding light on the basic principles of adult plasticity, with future implications in regenerative strategies.

A contínua formação de novos neurónios no cérebro adulto de mamíferos constitui uma das formas mais robustas de plasticidade neuronal que ocorre durante a idade adulta. Especificamente no giro denteado (GD) do hipocampo, as células estaminais neuronais residentes dão continuamente origem a novos neurónios maduros e funcionais, que integram os circuitos neuronais pré-existentes e contribuem para o funcionamento do cérebro. Este é um processo dinâmico, que requer um estreito controlo dos processos de proliferação e diferenciação das células dentro do nicho neurogénico. De fato, alterações neste processo estão associadas à manifestação de doenças neurodegenerativas e psiquiátricas. Assim, a existência de um processo de neurogénese ativo no cérebro adulto abre perspetivas para a regeneração do sistema nervoso central e, por seu lado, urge à necessidade em identificar fatores capazes de regular as células estaminais neuronais e a integração de novos neurónios. Recentemente, a proteína Lipocalina-2 (LCN2), envolvida no tráfico de ferro, surgiu como sendo importante na manutenção da homeostasia do cérebro e do comportamento animal, uma vez que controla a plasticidade neuronal ao nível da morfologia dos neurónios, da excitabilidade e da atividade sináptica. De salientar, a LCN2, através da ligação específica ao seu receptor 24p3R presente à superfície das células, é capaz de regular os níveis intracelulares de ferro e, assim, influenciar processos celulares distintos que incluem a proliferação, migração e sobrevivência, e a morte celular. Contudo, ainda é pouco reconhecido o controlo de ferro pela LCN2 na manutenção da homeostasia celular no contexto do cérebro. Deste modo, no presente trabalho, e com o intuito de explorar a sua importância no funcionamento do cérebro adulto e na génese de novas células, usou-se como modelo animal um murganho que não expressa Lcn2 (LCN2-null). Assim, no primeiro estudo, caraterizamos o impacto da ausência da LCN2 na manutenção e sobrevivência das células estaminais neuronais, assim como a sua contribuição para o funcionamento do cérebro em condições fisiológicas. Análises moleculares e celulares no GD revelaram que a deleção de LCN2 induz défices na progressão do ciclo celular das células estaminais, da sua proliferação e diferenciação, culminando em défices cognitivos avaliados na tarefa de discriminação de contextos. Especificamente, animais LCN2-null apresentaram um aumento da população de células estaminais, como consequência da incapacidade das células progredirem na fase G0/G1 do ciclo celular, devido ao aumento do stress oxidativo induzido pela acumulação de ferro. O tratamento dos animais com o quelante de ferro deferoxamina permitiu o resgate do stress oxidativo, a progressão no ciclo celular, e melhorou o índice de discriminação de contextos, o que sugere que a capacidade de tráfico de ferro pela LCN2 tem um papel central na regulação da neurogénese. Neste sentido, no segundo trabalho, dissecamos o impacto da ausência da LCN2 na regulação externa da atividade neurogénica. Para isso, os animais LCN2-null foram submetidos a um protocolo de exercício, de modo a promover o aumento da neurogénese, enquanto que a administração crónica de corticosterona serviu para reduzir a formação de novas células no hipocampo. De notar, o exercício melhorou significativamente os défices apresentados pelos animais LCN2-null, promovendo o aumento da proporção de progenitores no ciclo celular e da sua diferenciação em novos neurónios, resultando numa redução da ansiedade e num melhor índice de discriminação. Por outro lado, nenhum efeito foi observado após o stress: o tratamento crónico dos animais LCN2-null com corticosterona não agravou o fenótipo observado em condições fisiológicas, no que diz respeito à formação de novos neurónios e ao comportamento. Mesmo assim, estes resultados elucidam e implicam a LCN2 como um importante mediador da plasticidade neuronal e do funcionamento do cérebro adulto, quer em condições fisiológicas, quer após estimulação. Além disso, e considerando a quase inexistente informação relativa aos mecanismos que controlam o processo de envelhecimento, juntamente com as descrições na literatura do papel da LCN2 na neurodegeneração, neste trabalho caraterizamos o impacto da ausência de LCN2 no comportamento durante o processo de envelhecimento. Análise de níveis de ansiedade, depressão e cognição revelaram que o envelhecimento induz uma redução da ansiedade nos animais LCN2-null, mantendo o comportamento depressivo e os défices cognitivos observados em idades mais jovens. Estas alterações foram acompanhadas por uma significativa redução na sobrevivência celular e diferenciação neuronal no hipocampo, o que sugere a génese de novos neurónios como a base para as alterações observadas no comportamento com o envelhecimento. Em suma, os resultados aqui apresentados contribuíram para a identificação da LCN2 como um novo fator capaz de regular a plasticidade neuronal. Além disso, revelamos novos e únicos mecanismos subjacentes ao processo neurogénico no cérebro adulto, em condições fisiológicas e patológicas. Igualmente, os nossos resultados adicionam novas e importantes evidências sobre a forma como entendemos o processo neurogénico, abrindo caminho para o nosso conhecimento sobre os princípios básicos da plasticidade no cérebro adulto, com importantes e futuras implicações em estratégias regenerativas.