Understanding the role of KRAS hotspot mutations in KRAS/Galectin-3/p16INK4a axis regulation in colorectal cancer

Abstract

Colorectal Cancer (CRC) is a heterogeneous complex disease, which is the third most commonly diagnosed cancer worldwide. Despite the intensive follow-up and the novel therapeutic options for CRC patients, it remains as one of the most leading causes of cancerrelated deaths. CRC carcinogenesis results mainly from the serrated or from the adenomacarcinoma pathways, being associated with several mutations in key molecules. KRAS mutations are a very frequent event present in CRC being the hotspot mutations the following: KRASG13D, KRASG12D and KRASG12V. These mutations can lead to constitutively activation of KRAS proteins, which contribute to colorectal tumorigenesis, and no specific inhibitors are available what constitutes a clinical problem to overcome. Galectin-3 (Gal-3) belongs to galectins family and its function depends on its subcellular localization. Its abnormal localization is common in many types of human cancers, including CRC, and is correlated with cancer cell invasion and tumor angiogenesis. Recent studies shown that Gal-3 overexpression is associated with increased KRAS signal output, leading to increased cell proliferation, survival and migration. However, the interactions between Gal-3 and active KRAS are not fully understood. On its turn, p16INK4a is a tumor suppressor protein, G1 cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitor which loss occurs during malignant transformation. Since overexpression of KRAS can be induced by loss of p16INK4a the latter has been appointed with a crucial role in CRC carcinogenesis. In the present project, we aimed to study the role of KRAS in the regulation of KRAS/Galectin- 3/p16INK4a triple axis in CRC and the impact of the complex in CRC invasion and invasionassociated activities. Our results demonstrated for the first time using normal colon and CRC cells, that KRAS/Galectin-3/p16INK4a interact, forming a multiprotein complex which showed a feedback loop regulation. Moreover, we provided evidences that this complex might be a new mechanism of inactivation of the tumor suppressor gene p16INK4a by forcing its re-localization from the nucleus to the cytoplasm. Our data also identified KRAS and Gal-3 as important players in CRC migration and invasion. This work opens a new field of research, as understanding the role of KRAS/Galectin- 3/p16INK4a complex regulation on colorectal carcinogenesis might have relevant therapeutic implications.

O cancro colorretal é uma doença heterogénea complexa, que corresponde ao terceiro cancro mais frequentemente diagnosticado no mundo. Apesar do acompanhamento intensivo dos pacientes e dos últimos avanços terapêuticos, é ainda uma das principais causas de morte associadas a cancro. O seu processo de carcinogénese resulta principalmente das vias serreada e adenoma-carcinoma, estando associado a mutações em moléculas chave. As mutações do gene KRAS são eventos muito frequentes no cancro colorretal sendo as mutações mais comuns as seguintes: KRASG13D, KRASG12D e KRASG12V. Estas mutações podem levar à ativação constitutiva das proteínas KRAS, contribuindo para a tumorigénese, não havendo inibidores específicos do KRAS o que é um problema clínico que precisa de resolução. A Galectina-3 pertence à família das galectinas e a sua função depende da sua localização subcelular. A sua localização anormal é frequente em vários tipos de cancros, incluindo no cancro colorretal, e está relacionada com a invasão e angiogénese do tumor. Estudos recentes demonstraram que a sobreexpressão da proteína Gal-3 está associada ao aumento da sinalização mediada pelo KRAS, resultando no acréscimo da proliferação, sobrevivência e migração celulares. No entanto, as interações entre a Galectina-3 e a proteína KRAS ativada não estão ainda completamente compreendidas. Por sua vez, a p16INK4a é uma proteína supressora de tumores, inibidora G1 da cinase dependente de ciclina cuja perda ocorre frequentemente durante a transformação maligna dos tumores. Uma vez que a sobreexpressão da proteína KRAS pode ser induzida pela perda da expressão da p16INK4a, pensa-se que a última tenha também um papel muito importante na carcinogénese colorretal. No presente projeto, pretendemos estudar o papel da proteína KRAS na regulação do eixo KRAS/Galectin-3/p16INK4a no cancro colorretal e o impacto deste complexo na invasão e nas atividades associadas à invasão tumoral. Os nossos estudos, utilizando linhas celulares colorretais normais e cancerígenas, demonstraram, pela primeira vez, que as proteínas KRAS/Galectin-3/p16INK4a interagem entre si formando um complexo de regulação recíproca. Apresentamos ainda, evidências de que este complexo pode ser um novo mecanismo de inativação da proteína supressora tumoral p16INK4a, por forçar a sua relocalização do núcleo para o citoplasma. Os nossos dados também identificaram o KRAS e a Galectina-3 como intervenientes importantes na migração e invasão das células colorretais. Este trabalho abre novas perspetivas de investigação sobre o papel da regulação do complexo KRAS/Galectin-3/p16INK4a na carcinogénese colorretal que poderá ter implicações terapêuticas relevantes.