The role of mitochondrial effectors of cell death in Δisc1 mutants

Abstract

Mitochondria are fundamental elements of the eukaryotic cell that have a wide variety of functions, including generation of metabolic energy through oxidative phosphorylation and biosynthesis of many key metabolites. In addition to the role in energy metabolism, regulation of cell death and ageing have recently emerged as a second major function of these organelles in humans and yeast. In recent years, the role of sphingolipids in mitochondria function, redox homeostasis and lifespan has attracted high attention due to their function in the regulation of stress responses, cell growth, differentiation, cell cycle arrest, endocytosis, ageing and apoptosis. In particular, ceramide is a bioactive sphingolipid that modulates cellular processes such as apoptosis and ageing. Saccharomyces cerevisiae has been used to understand the pathways involved in sphingolipid metabolism and their role in mitochondria function due to its simplicity in comparison with mammalian systems. Isc1p, the yeast orthologue of mammalian neutral sphingomyelinase (nSMase2), plays a crucial role in oxidative stress and chronological lifespan. It regulates ceramide levels and modulates ceramide signalling pathways that control mitochondria morphology and functional properties, as well as mitochondria-mediated cell death pathways. The knockout of ISC1 leads to an increase in sensitivity to oxidative stress and a premature ageing phenotype, and its short lifespan is mediated by cell death by apoptosis. The main goal of this work was to uncover the role of mitochondrial effectors of cell death in Δisc1 mutants. Previous studies indicated that deletion of the internal mitochondrial ubiquinone oxidoreductase (NDI1) or of the yeast orthologue of endonuclease G (NUC1) reverts the premature ageing of Δisc1 mutants. In order to identify the protein targets and mediators of signalling pathways that are deregulated in Δisc1 cells, and to characterize how these changes are related to Δisc1 phenotypes, in this work the role of Nuc1p and Ndi1p in Δisc1 phenotypes was investigated. The overall results will contribute to the characterization of the role of neutral sphingomyelinases and sphingolipid signaling in the modulation of mitochondria function to improve our understanding of processes associated with sphingolipid-related disorders, including ageing.

A mitocôndria é um organelo fundamental da célula eucariótica que possui uma variedade de funções, incluindo a geração de energia metabólica, através da fosforilação oxidativa e da biossíntese de muitos metabolitos essenciais. Para além do seu papel no metabolismo energético, a regulação da morte e envelhecimento celular emergiram recentemente como uma segunda função deste organelo em mamíferos e leveduras. Recentemente, o papel dos esfingolípidos na função mitocondrial, na homeostasia redox e na longevidade tem atraído uma crescente atenção devido à sua função na regulação de respostas ao stress, crescimento celular, diferenciação, paragem no ciclo celular, endocitose, envelhecimento e apoptose. A ceramida é um esfingolípido bioactivo que modula processos celulares como o envelhecimento celular e a apoptose. A levedura Saccharomyces cerevisiae tem sido utilizada para compreender as vias envolvidas no metabolismo dos esfingolípidos e o seu papel nas funções mitocondriais devido à sua simplicidade quando comparada com os mamíferos. A proteína Isc1p, ortóloga da esfingomielinase neutra dos mamíferos (nSMase2), desempenha um papel crucial no stress oxidativo e na longevidade pois regula os níveis de ceramida e modula as vias de sinalização desta que controlam a morfologia e as propriedades funcionais, bem como as vias de morte celular mediadas pela mitocôndria. A deleção do gene ISC1 promove um aumento da sensibilidade das células ao stress oxidativo e um fenótipo de envelhecimento prematuro mediado por apoptose. O principal objectivo deste trabalho foi compreender o papel da proteína Isc1p na modulação das funções mitocondriais. Foi demonstrado, através de estudos anteriores, que a deleção do gene NDI1 ou NUC1, que codificam para a ubiquinona oxidoreductase da membrana mitocondrial interna e para o ortólogo da endonuclease G na levedura, respectivamente, reverte o envelhecimento prematuro dos mutantes Δisc1. Neste trabalho, foi investigado mais detalhadamente o papel de Nuc1p e Ndi1p no fenótipo apoptótico do mutante Δisc1 e no stress oxidativo durante o envelhecimento cronológico. Pretendeu-se assim identificar quais os alvos proteicos e mediadores das vias de sinalização que estão desregulados nos mutantes Δisc1 e caracterizar de que forma essas alterações estão relacionadas com os fenótipos do mutante Δisc1. Em suma, os resultados contribuirão para a caracterização do papel das esfingomielinases neutras, bem como da sinalização mediada por esfingolípidos, na modulação das funções mitocondriais, permitindo uma melhor compreensão dos processos associados a perturbações na homeostase de esfingolípidos como, por exemplo, o envelhecimento celular.