Regulation of Wnt signaling by HOXA9 in Glioblastoma: Mechanistic, prognostic and therapeutic insights

Abstract

Glioblastomas (GBMs) are the most common and malignant type of gliomas, a heterogeneous group of neoplasias that account for the majority of primary brain tumors. Clinically, GBMs present one of the highest cancer-related average years of life lost with a median survival of ≈15 months. Moreover, while the clinical outcome of GBM patients is particularly unpredictable, patients are equally treated with a standardized approach, consisting of surgical resection, radiotherapy and chemotherapy, mostly with temozolomide. To overcome this problem of a universal therapy to strikingly heterogeneous tumors, the identification of molecular prognostic factors that allow the stratification of subgroups of GBM patients is crucial. Nowadays, none of the suggested prognostic factors is sufficiently satisfactory to be used in clinics. The identification of new biomarkers, together with the understanding of their functional roles in GBM, may be a first step in the design of novel therapeutic approaches. Our group has recently shown that HOXA9 overexpression is associated with poor prognosis in GBM patients. Functionally, overexpression of HOXA9 in GBM in vitro models is associated with pro-proliferative and antiapoptotic features. Since HOXA9 is a transcription factor, its targets can be the true biological effectors of its aggressiveness. Bioinformatics analysis of HOXA9 transcriptome using GSEA revealed that it is enriched to several components of the Wnt pathway. Aberrant activation of Wnt signaling has been reported in several tumors and associated with cancer stem cell-like features, including increased proliferation and therapy resistance. By chromatin immunoprecipitation, we found that HOXA9 binds to the promoter region of WNT6, a key gene of this pathway. In addition, we demonstrated that WNT6 is also regulated by methylation in GBM, and that WNT6 DNA methylation levels are associated with HOXA9 expression in our GBM in vitro models. Additionally, we found that WNT6 is overexpressed in GBMs, but not low-grade gliomas nor normal brain. Moreover, high WNT6 expression was particularly frequent in the proneural GBM subtype. Importantly, we provide the first evidence of the clinical prognostic value of WNT6 in GBM, implicating high levels of WNT6 as a novel independent negative prognostic marker. Preliminary data of pharmacological inhibitions of Wnt signaling suggests that the Wnt pathway can be an attractive therapeutic target directed to HOXA9-positive GBMs. Together, our findings provide mechanistic, prognostic and therapeutic insights into the role of Wnt pathway in GBM.

Os Glioblastomas (GBMs) são o glioma mais comum e maligno, sendo um grupo heterogéneo de neoplasias que conta com a maioria dos tumores primários do cérebro. Clinicamente, os GBMs apresentam uma das maiores médias de anos de vida perdidos devido ao cancro, tendo como média de sobrevivência ≈15 meses. Embora a resposta clínica destes pacientes seja particularmente imprevisível, todos são tratados com uma terapia padrão, que consiste na ressecção cirúrgica, radioterapia e quimioterapia, maioritariamente feita com temozolamida. Para ultrapassar este problema duma terapia universal para tumores altamente heterogéneos, é crucial a identificação de factores moleculares de prognóstico que permitam a estratificação dos pacientes em subgrupos. Actualmente, nenhum dos fatores de prognóstico sugeridos é suficientemente satisfatório para ser usado na clínica. A identificação de novos biomarcadores, juntamente com a compreensão dos seus papéis em GBMs, pode ser o primeiro passo no desenho de novas abordagens terapêuticas. Recentemente, o nosso grupo mostrou que a sobre-expressão do HOXA9 está associada a um pior prognóstico destes pacientes. Funcionalmente, esta sobre-expressão, em modelos in vitro de GBM, está associada a propriedades pró-proliferativas e anti-apoptóticas. Uma vez que o HOXA9 é um fator de transcrição, os seus alvos podem ser os verdadeiros efetores biológicos da sua agressividade. Análises bioinformáticas do transcriptoma do HOXA9, usando o GSEA, revelaram que este está enriquecido para diversos componentes da via Wnt. A ativação aberrante desta via foi reportada em cancro e associada a um fenótipo semelhante aos das células estaminais, incluindo um aumento da proliferação e resistência à terapia. Por imunoprecipitação da cromatina, vimos que o HOXA9 se liga à região promotora do WNT6, um gene crucial na via Wnt. Mais ainda, demonstramos que o WNT6 é também regulado por metilação do DNA em GBM. Além disso, nos nossos modelos in vitro de GBM, os seus níveis de metilação estão associados aos níveis de expressão do HOXA9. Adicionalmente, vimos que o WNT6 está exclusivamente sobre-expresso em GBM. Além disso, altos níveis de expressão do WNT6 são particularmente frequentes no subtipo proneural dos GBMs. Mais importante ainda, fornecemos a primeira evidência do valor clínico de prognóstico do WNT6 em GBM, implicando os seus altos níveis como um novo marcador de prognóstico negativo independente. Resultados preliminares da inibição farmacológica da via de Wnt sugerem que esta via pode ser um alvo terapêutico atrativo direcionado a células positivas para o HOXA9. Em conjunto, os nossos resultados fornecem uma perspectiva mecanística, prognóstica e terapêutica sobre o papel da via Wnt em GBMs.