Utilize este identificador para referenciar este registo:
https://hdl.handle.net/1822/35712
Título: | Functional characterization of mitochondrial suspensions by cytofluorimetric techniques towards the screening of mitochondrial target drugs |
Autor(es): | Loureiro, Luís Carlos Sá |
Orientador(es): | Côrte-Real, Manuela Gerós, H. |
Data: | 2015 |
Resumo(s): | Besides its role in respiration, mitochondria control other key metabolic
pathways, cell proliferation and regulated cell death, with a crucial role in the
regulation of the intrinsic apoptotic pathway. Recent studies have focused on the
screen for anti-cancer agents that induce apoptosis through permeabilization of the
mitochondrial outer membrane, leading to the cytosolic release of pro-apoptotic
proteins and to the activation of the caspase cascade and consequently to cell
dismantling.
In the present study, staining protocols were developed and optimized aiming
at the structural and functional characterization of isolated mitochondrial populations
from yeast cells and rat liver by flow cytometry. Mitotracker Green and Nonyl Acridine
Orange were used to measure changes in mitochondrial mass, 3,3'-
Dihexyloxacarbocyanine Iodide and Mitotracker Red CMXROS to monitor the electrical
potential of the inner membrane (Δψm), Mitotracker Red CM-H2XROS and
Dihydroethidium to evaluate the accumulation of ROS, and 2',7'-Bis-(2-Carboxyethyl)-
5-(and-6)-Carboxyfluorescein and Acetoxymethyl Ester (BCECF-AM) to measure the pH
of the mitochondrial matrix. Subsequent flow cytometry studies were designed to
evaluate the effect in mitochondria function of two well-known apoptosis inducers in
both mammalian cell lines and yeast cells, namely bovine lactoferrin (bLf) and acetate,
and to understand whether or not they act directly on mitochondria independently of
upstream cellular pathways. The results showed that both bLf and acetate promoted
changes in mitochondrial mass, matrix mitochondrial pH, Δψm and ROS levels of rat
liver mitochondria. Moreover, the assessment of the activity of the complexes of
electron transport chain (ETC) showed that bLf and acetate affect their activity and
trigger mitochondrial swelling. These results are particularly interesting since the two
compounds appear to induce in isolated mitochondria mainly the same alterations as
those occurring in whole cells, and which have been proposed to be involved in the
induction of cell death. Altogether, this study show that flow cytometry is a valuable
tool to study key mitochondrial functional parameters and to screen for mitochondriatargeted
drugs, including the anticancer agents, such as acetate and bLf. Para além do seu papel na respiração celular, as mitocôndrias controlam outros aspetos chaves do metabolismo, bem como a proliferação celular e a morte celular regulada, tendo um papel crucial na regulação da via apoptótica intrínseca. Estudos recentes têm-se focado na procura de agentes anticancerígenos capazes de induzir apoptose mediada pela permeabilização da membrana mitocondrial externa, conduzindo à libertação de proteínas pró-apoptóticas e à ativação da cascata de caspases e consequente desmantelamento celular. No presente estudo, foram desenvolvidos e otimizados protocolos de marcação com vista à caracterização estrutural e funcional por citometria de fluxo de populações de mitocôndrias isoladas de células de levedura e de hepatócitos de rato. As sondas Mitotracker Green e laranja de nonil-acridina foram usadas para medir variações da massa mitocondrial, o iodeto de 3,3'-Dihexiloxacarbocianina e o Mitotracker Red CMXROS para medir o potencial eléctrico da membrana mitocondrial interna (Δψm), o Mitotracker Red CM-H2XROS e dihidroetídeo para avaliar a acumulação de ROS e o acetoximetil éster de (2',7'-Bis-(2- Carboxietil)-5-(and-6)-carboxifluoresceína e(BCECF-AM) para medir o pH da matriz mitocondrial. Os estudos subsequentes de citometria de fluxo foram desenhados para avaliar o efeito de diferentes drogas na função mitocondrial, em particular da lactoferrina bovina (bLf) e do acetato, dois reconhecidos indutores de apoptose, no sentido de se compreender se atuam diretamente na mitocôndria independentemente de outras vias celulares a montante. Os resultados mostraram que tanto a bLf como o acetato promovem alterações na massa mitocondrial, pH da matriz mitocondrial, Δψm e nos níveis de ROS em mitocôndrias isoladas de fígado de rato. Além disso, a avaliação da atividade dos complexos da cadeia de transportadora de eletrões (ETC) mostrou que a bLf e o acetato afetam a sua atividade e desencadeiam a tumefação mitocondrial. Estes resultados são particularmente interessantes uma vez que os dois compostos parecem induzir, em mitocôndrias isoladas as mesmas alterações que ocorrem em células inteiras, e que têm sido propostas como estando envolvidas na indução da morte celular. No seu conjunto, este estudo mostra que a citometria de fluxo é uma ferramenta valiosa para o estudo da funcionalidade mitocondrial e para o rastreio de drogas que têm como alvo a mitocôndria, incluindo agentes anticancerígenos, tais como a bLf e o acetato. |
Tipo: | Dissertação de mestrado |
Descrição: | Dissertação de mestrado em Bioquímica Aplicada |
URI: | https://hdl.handle.net/1822/35712 |
Acesso: | Acesso aberto |
Aparece nas coleções: | BUM - Dissertações de Mestrado |
Ficheiros deste registo:
Ficheiro | Descrição | Tamanho | Formato | |
---|---|---|---|---|
Luís Carlos Sá Loureiro.pdf | 3,89 MB | Adobe PDF | Ver/Abrir |