Validation of neuronal inclusions as a biomarker for pre-clinical trials in a mouse model of Machado-Joseph disease

Abstract

Polyglutamine disorders are a class of nine inherited neurodegenerative disorders caused by expansion of a CAG repeat within otherwise unrelated genes. Polyglutamine expansion causes aberrant protein misfolding that leads to formation of protein aggregation and neuronal loss. Machado-Joseph disease (MJD) is included in this group of disorders, being caused by expansion of a CAG tract in the C-terminal region of the protein Ataxin-3 (ATXN3). MJD is characterized by the formation of intranuclear neuronal inclusions (NIs) and nervous system dysfunction, but the mechanism of this ATXN3- mediated dysfunction is still unsolved. So far, some symptoms can be controlled with specific treatments, but there is no effective therapy for MJD. Our team previously established a new MJD mouse model expressing human ATXN3 with 135 glutamines – CMVMJD135 – that presents phenotypic, pathologic and genetic similarities with the human disorder, namely several reliable and quantifiable phenotypic markers that can be used in therapeutic trials. The NFIs are a pathological hallmark of this disease and have been found in this mouse model, as happens in human patients. Many studies related with therapeutic targets in polyQ diseases reveal phenotype amelioration without mention to neuropathology, namely inclusion load. Immunohistochemistry was performed to evaluate the relevance of inclusion load assessment in pre-clinical trials using a mouse model of MJD. We evaluated the utility of using this biomarker in therapeutic trials using three pharmacological compounds: creatine, 17-DMAG and valproic acid. We have found a significant reduction in inclusion load in the lateral reticular nucleus (LRT) region and a tendency towards a reduction of neuronal inclusions in the facial nuclei (7N) region of CMVMJD135 mice treated with creatine. The chronic treatment with creatine also lead to an amelioration of the motor phenotype observed in these animals, namely an increase in muscle strength and a better motor performance in the motor swimming test. Another compound, 17-DMAG did not show any differences between treated and non-treated transgenic mice group regarding NIs in the LRT and 7N brain regions, although a phenotype amelioration was observed in several behavioral paradigms. CMVMJD135 mice treated with Valproic acid exhibit a tendency towards a reduction of neuronal inclusions load in the LRt but no reduction in inclusion load in the 7N brain region. Globally our results suggest that there is no direct correlation between the aggregate load in these brain regions of the CMVMJD135 mice and the phenotypic effect observed upon chronic treatment with different compounds.

As doenças de poliglutaminas são um conjunto de doenças neurodegenerativas hereditárias causadas pela expansão de um tripleto de CAG nas regiões codificantes dos respetivos genes causadores. A expansão do tripleto CAG leva à formação de proteínas que possuem uma expansão anormal de uma sequência de poliglutamina, causando o seu desarranjo conformacional, podendo estas proteínas agregar e conduzir à morte neuronal num estadio mais avançado da doença. A doença de Machado-Joseph (DMJ) inclui-se neste grupo de doenças, sendo caracterizada por uma expansão de glutaminas localizada na região Cterminal da proteína envolvida na DMJ, a ataxina-3 (ATXN3). São características comuns a todas as doenças de poliglutaminas a presença de inclusões proteicas intranucleares nos neurónios (IINs) e a disfunção neuronal. No entanto, permanece por esclarecer a relevância das IINsna patogénese da DMJ. Até à data, embora seja possível controlar alguma da sintomatologia observada nos doentes, não existe um tratamento eficaz para a DMJ. No presente estudo, utilizou-se um modelo de ratinho para a DMJ que foi previamente gerado no nosso laboratório, e que apresenta várias características semelhantes às da doença humana, quer a nível genético e fenotípico, quer a nível neuropatológico. Este modelo apresenta características passíveis de quantificação, permitindo o seu uso em ensaios pre-clínicos. As IINs são uma característica chave da DMJ e foram detetadas nos cérebros deste modelo. Vários ensaios pré-clínicos recorrendo a várias estratégias terapêuticas e a diferentes modelos de ratinho, demonstram uma melhoria do fenótipo observado em cada modelo, no entanto, a referência ao efeito dos compostos utilizados na quantidade de agregados proteicos não é clara. Numa tentativa de esclarecer a relação entre a melhoria no fenótipo e a quantidade de IINs nos cérebros dos ratinhos CMVMJD135, foi efetuado um estudo de quantificação das IINs em algumas regiões do cérebro relevantes na DMJ, após o tratamento crónico dos ratinhos com três compostos: creatina, 17-DMAG e ácido valpróico. Foi possível observar uma redução significativa da densidade de IINs no LRT e uma tendência para o mesmo resultado no 7N nos animais tratados com creatina, quando comparados com animais veículo. Assim, e tendo em conta que a creatina apresentou um efeito benéfico nos sintomas motores e também melhorou a perda de força muscular dos animais transgénicos, pode dizer-se que existe uma correlação direta entre densidade de IINs positivos para a ATXN3 e o efeito positivo no fenótipo destes animais. Em contraste, apesar de o 17-DMAG ter tido um efeito positivo no fenótipo dos animais, não foi observada uma redução da densidade de IINs nos núcleos LRT e 7N. Por fim, o ácido valpróico demonstrou ter um efeito muito ligeiro e tardio no fenótipo dos animais, não tendo sido observada uma redução significativa da densidade dasIINs nas áreas acima referidas. Globalmente, estes resultados demonstram que não existe uma relação direta entre densidade de IINs nestas regiões e a melhoria a nível fenotípico dos animais transgénicos para a DMJ.