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https://hdl.handle.net/1822/29565
Título: | Physicochemical characterization of DNA/DODAB:MO Cationic Liposome complexes and study of its potential as nonviral vectors |
Autor(es): | Silva, João Paulo Neves da |
Orientador(es): | Real Oliveira, M. Elisabete C.D. Coutinho, Paulo J. G. Coutinho, O. P. |
Data: | 12-Dez-2013 |
Resumo(s): | Throughout the last decades, several liposomal formulations have been developed with the goal of
condensing, transporting and releasing complementary DNA (cDNA) into cells, thus allowing the
treatment of several genetic diseases via DNA replacement therapy. Although this technology has
been partially substituted with the more contemporary use of small interference RNA (siRNA)
therapy, the intracellular delivery of cDNA still remains the only viable gene therapy approach for
stable host genome modification instead of transient transfection. The success of lipofection
technique greatly depends on the structural and physicochemical properties of the liposomal
carrier and ultimately, on the molecular attributes of the components of the lipid mixture. The
empirical testing of diverse families of lipids such as cationic surfactants, pH-sensitive tensioactives
or other lipid conjugates has allowed the development of highly efficient nanoparticles that stably
condense the genetic material and withstand the harsh destabilizing conditions of the biological
environment. However, it is this very same increased carrier stability that is responsible for limiting
the gene release from the nucleic acid (NA)/cationic liposome complex (lipoplex) and reducing its
final cell transfection efficiency.
One recent approach to overcome this problem has come with the inclusion of non-lamellar forming lipids (also called helper lipids) in the liposomal formulation, which potentiate the formation of
membrane fusion intermediates that disrupt the lamellar organization of the lipoplexes and favour
the release of the genetic content. Molecules such as dioleoylphosphatidyl ethanolamine (DOPE)
and cholesterol (Chol) have been employed with success as helper lipids in several liposomal
formulations, enhancing the lipofection efficiency through the formation of inverted hexagonal
structures (HII).
Adopting a similar strategy, the work plan for this thesis was focused on the development of a new
nucleic acid (NA)/cationic liposome formulation for gene delivery purposes comprising the
synthetic cationic lipid Dioctadecyl Dimethylammonium Bromide (DODAB) and the non-ionic and
non-lamellar forming lipid Monooleoyl-rac-glycerol (monoolein, MO). The structural and
physicochemical characterization of DODAB:MO liposomes and DNA/DODAB:MO lipoplexes has been done through light scattering, microscopy, spectroscopy (with emphasis in UV/Visible
fluorescence emission) and calorimetry techniques. The lipoplex formation process has been
studied through the same techniques referred above at varying molar fractions of cationic
lipid/DNA and cationic lipid/neutral lipid, while lipoplex destabilization was assessed by incubation
of the pre-formed lipoplexes in several physiological simulation environments (salt, serum,
temperature, pH, anionic lipids). Finally, the cell transfection efficiency and cytotoxicity profile of
these non-viral gene delivery vectors was assessed by β-galactosidase reporter gene expression
and Lactate Dehydrogenase (LDH) cell viability assays, respectively, in the 293T human embryonic
kidney cell line. The results attained substantiate the high potential for DNA/DODAB:MO lipoplexes
to be used as nonviral vectors in gene delivery, and validate the application of MO as helper lipid
in cationic liposome formulations, being a viable alternative to classic DOPE and Chol molecules. Ao longo das últimas décadas, várias formulações lipossomais têm sido desenvolvidas com o intuito de condensar, transportar e libertar DNA complementar (cDNA) em células, permitindo o tratamento de várias doenças genéticas através da terapêutica de substituição de DNA. Embora esta tecnologia tenha sido parcialmente substituída pelo uso mais contemporâneo da terapêutica de RNA de interferência (microRNA), a entrega intracelular de cDNA permanece ainda como a única alternativa viável para a modificação genómica definitiva do hospedeiro em vez da transfeção transiente. O sucesso da técnica de lipofeção depende grandemente das propriedades estruturais e físico-químicas do vetor lipossomal e, em última instância, das propriedades moleculares dos constituintes da formulação lipídica. O teste empírico de diversas famílias de lípidos tais como os surfatantes catiónicos, os tensioativos sensíveis a pH ou outros conjugados lipídicos permitiu o desenvolvimento de nanopartículas altamente eficientes capazes de condensar estavelmente o material genético e suportarem as agressivas condições desestabilizantes do microambiente biológico. Contudo, é esta mesma estabilidade acrescida dos vetores que é responsável por limitar a libertação de genes dos complexos DNA/lipossomas catiónicos (lipoplexos) e reduzir a eficiência final de transfeção celular. Uma abordagem recente para ultrapassar este problema proveio da inclusão de lípidos nãolamelares (também chamados de lípidos adjuvantes) na formulação lipossomal, que potenciam a formação de intermediários membranares fusogénicos que desestabilizam a organização lamelar dos lipoplexos e favorecem a libertação do conteúdo genético. Moléculas tais como dioleoilfosfatidil etanolamina (DOPE) e colesterol (Chol) têm sido utilizadas com sucesso como adjuvantes em várias formulações lipossomais, aumentando a eficiência de lipofeção através da formação de estruturas hexagonais invertidas (HII). Adotando uma estratégia similar, o plano de trabalhos para esta tese contemplou o desenvolvimento de uma nova formulação ácido nucleico (NA)/lipossoma catiónico para efeitos de entrega genética, composta pelo lípido catiónico sintético Brometo de Dioctadecil Dimetilamónio (DODAB) e o lípido não-iónico e não-lamelar Monooleína (MO). A caracterização estrutural e físico química dos lipossomas DODAB:MO e lipoplexos DNA/DODAB:MO foi feita através das técnicas de dispersão de luz, microscopia, espetroscopia (com ênfase na emissão de fluorescência UV/Visível) e calorimetria. O processo de formação dos lipoplexos foi estudado através das mesmas técnicas referidas anteriormente em frações variáveis de lipossomas catiónicos/DNA e de lípido catiónico/lípido neutral, enquanto a desestabilização dos lipoplexos foi avaliada pela incubação dos lipoplexos recém-formados em diversos microambientes fisiológicos simulados (sal, soro, temperatura, pH, lípidos aniónicos). Finalmente, a eficiência de transfeção celular e o perfil citotóxico destes vetores genéticos não-virais foi avaliada por ensaios de expressão do gene repórter β-galactosidase e ensaios de viabilidade celular com a enzima Lactato Desidrogenase (LDH), respetivamente, na linha celular 293T derivada de rim embrionário humano. Os resultados obtidos substanciam o elevado potencial dos lipoplexos DNA/DODAB:MO para serem usados como vetores não-virais em entrega genética, e validam a aplicação de MO como lípido adjuvante em formulações de lipossomas catiónicos, apresentando-se como uma alternativa viável às moléculas clássicas DOPE e Chol. |
Tipo: | Tese de doutoramento |
Descrição: | Tese de doutoramento em Ciências (área de especialização em Física) |
URI: | https://hdl.handle.net/1822/29565 |
Acesso: | Acesso restrito UMinho |
Aparece nas coleções: | CDF - FAMO - Teses de Doutoramento/PhD Thesis |
Ficheiros deste registo:
Ficheiro | Descrição | Tamanho | Formato | |
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João Paulo Neves da Silva.pdf Acesso restrito! | 14,35 MB | Adobe PDF | Ver/Abrir |