Unravel key elements of tissue engineering constructs in the route to skin regeneration

Abstract

Natural skin wound healing in humans, with the exception of a short period during foetal stage, occurs via repair mechanisms often resulting in the formation of contractile fibrotic tissue with a highly disorganized extracellular matrix (ECM), limited function and lacking skin appendages. Aiming at overcoming this problematic, numerous tissue engineering (TE) approaches have been suggested resulting in a set of epidermal, dermal, and combined skin tissue-engineered constructs already with a long history of commercialization and clinical availability, yet with limited success. This classical tissue replacement, where skin morphology and arrangement is mimicked, has in fact been increasingly set aside. The costly and extended timeframe production mainly associated to cell expansion requirements, the unsatisfactory outcome due to poor analogues survival and integration, as well as incomplete regeneration, have been indicated as the most relevant causes. Another obstacle that has been associated with restrained long-term function of skin equivalents, is the terminal differentiation of the grafted epidermal cells due to prolonged in vitro culture exhibiting a reduced number of highly proliferative units. Currently, more refined and superior skin tissue engineered alternatives focusing on regeneration rather than replacement are required. Moreover, a gradual understanding of the biological processes and major key players involved in wound healing are expected to enlarge the possibilities to develop functional substitutes capable of leading skin regeneration. In this thesis a major objective was to propose 3D skin TE strategies, taking advantage of major players of the healing process, cells and ECM, as innovative routes towards regenerated skin. The in vivo role of these two main tools has been described as highly dynamic in modelling the wound healing progression. However, also dependent on the type of cells used, as well as on their 3D arrangement, mainly defined by cell-cell and cell-matrix interactions. Following this perspective, artificial niches integrating the potential of intrinsic cellular machinery and natural or ECM-like 3D microenvironments were exploited by raising two main questions. In a dynamic and orchestrated perspective, the need for a classic epidermal-dermal organization that is commonly pursued for skin analogues, was investigated by proposing either organized cell sheet (CS)-based constructs with relevant skin cell lineages embedded in their own ECM, or a 3D spongy-like hydrogel system with the skin cellular fractions randomly entrapped. Different combinations of CS of relevant skin lineages, produced though CS engineering technology, impacted early wound re-epithelialization and enhanced neotissue vascularization, promoted by epidermal-endothelial interactions. In opposition dissociated skin cellular fractions entrapped in gellan gum-hyaluronic acid (GG-HA) spongylike hydrogels, failed to self-organize within the artificial template, as hypothesized. The extent of the potential of stem cell-based approaches to improve skin wound healing was also investigated. A new methodology to uncover and boost a superior epidermal stemlike cell fraction among primary keratinocytes freshly isolated from adult human cells was proposed, opening the possibilities for further sophisticated studies and tackling the limited functionality of expanded primary keratinocytes. Additionally, the potential of cells abundantly obtained from adipose tissue, as the cellular machinery of sophisticated, but rapidly assembled constructs was explored. Human adipose stem cells (hASCs) embedded in their natural ECM were found to target neoepidermis morphogenesis by interacting with host keratinocytes in a paracrine manner. However, per se, hASCs did not additionally contributed to the effect of the GG-HA spongy-like hydrogel system that in turn synergized with cocultured adipose tissue microvascular endothelial cells and hASCs towards a fast matrix remodelling and improved healing. All the proposed strategies were based in a short-timeframe production principle, crucial in a clinical mindset, as the current alternatives require a long time period of preparation. Under this context, CS-based constructs were produced in a five-day period, whereas artificial ECM-like constructs were assembled from off-the-shelf dried polymeric networks that give rise to spongy-like hydrogels upon re-hydration with freshly isolated or short term expanded cells just prior implantation. The outcomes of the explored strategies showed to be strongly associated with cell-cell and cell-ECM interactions. Additionally, the architectural skin recreation appears to play a secondary role on the effectiveness of the strategies used. Moreover, stem cells potential was maximized by promoting the direct interaction between transplanted and host cells.

A cicatrização de feridas na pele dos seres humanos, à excepção de um curto período durante o estadio fetal, ocorre através de mecanismos de reparação, resultando muitas vezes na formação de tecido fibrótico contrátil com uma matriz extracelular altamente desorganizada, com função limitada e ausência de órgãos anexos. Com vista a ultrapassar esta problemática, têm sido sugeridas numerosas abordagens de engenharia de tecidos, resultando na criação de vários substitutos da epiderme, derme ou substitutos combinados, tendo já uma longa história de comercialização e disponibilidade clínica, apesar do seu sucesso ser limitado. Esta abordagem clássica de substituição da pele, imitando a sua morfologia e organização tem sido cada vez mais abandonada. A produção dispendiosa e o período de tempo alargado, que se deve principalmente aos requisitos para a expansão celular, à baixa sobrevivência e integração dos análogos, bem como a uma regeneração incompleta, têm sido apontadas como as causas mais importantes. Outra dificuldade que tem sido associada à função limitada de equivalentes de pele ao longo do tempo, é a diferenciação terminal das células da epiderme, que exibe um reduzido número de unidades altamente proliferativas devido à prolongada cultura in vitro. Actualmente são então necessárias alternativas de engenharia de tecidos de pele que promovam a regeneração, em vez da reparação. Para além disso, espera-se que, através da compreensão gradual dos processos biológicos e dos principais intervenientes envolvidos na cicatrização de feridas, as possibilidades de desenvolver substitutos funcionais capazes de conduzir a regeneração da pele sejam ampliadas. Um dos objectivos principais desta tese foi propor estratégias de engenharia de pele tridimensionais, tirando partido dos principais intervenientes do processo de cicatrização, as células e a matriz extracelular, como trajectos inovadores até uma pele regenerada. O papel destas duas ferramentas principais in vivo foi descrito como altamente dinâmico, no processo de progressão da cicatrização de feridas. No entanto, dependente do tipo de células utilizado, bem como a sua disposição tridimensional, principalmente definida pelas interacções célula-célula e célula-matriz extracelular. Seguindo esta perspectiva, nichos artificiais que integram o potencial da maquinaria celular intrínseca e microambientes 3D naturais ou extracelular matrix-like (ECM-like), foram explorados, levando à formulação duas perguntas principais. Numa perspectiva dinâmica e integrada, a necessidade de organização epidérmica-dérmica clássica, que é normalmente utilizada em análogos da pele, foi investigada, propondo tanto cell sheet (CS)-based constructs organizados com células da pele incorporadas na sua própria matriz extracelular, como um sistema tridimensional spongy-like hydrogel 3D contendo fracções celulares da pele, dispostas aleatoriamente no seu interior. Diferentes combinações de CS com células de pele, produzidas por CS engineering, mostraram um impacto na aceleração da re-epitelização e melhoramento da vascularização, promovida por interacções de células da epiderme-endoteliais. Por outro lado, ao contrário do que foi proposto, as fracções celulares da pele dissociadas aprisionadas em spongy-like hydrogels, de goma gelana e ácido hialurónico não se auto-organizaram no interior deste modelo artificial. A dimensão do potencial de abordagens baseadas em células estaminais para melhorar a cicatrização de feridas da pele foi também examinada. Foi proposta uma nova metodologia para deslindar e aumentar a fracção de stem-like cells da epiderme entre queratinócitos primários recém-isoladas a partir de células humanas adultas, aumentando as possibilidades para estudos mais sofisticados e para combater a funcionalidade limitada dos queratinócitos primários, observada aquando da expansão dos mesmos. Para além disso, foi explorado o potencial da maquinaria celular de constructs formados a partir de células obtidas de tecido adiposo, de uma forma sofisticada, mas ainda rápida. As células estaminais humanas de tecido adiposo, embebidas na sua matriz extracelular nativa, mostraram-se capazes de promover a morfogénese da neo-epiderme, através de sinalização parácrina com os queratinócitos do hospedeiro. No entanto, por si só, estas células estaminais humanas do tecido adiposo não contribuíram para um efeito adicional observado nos spongy-like hydrogels, que necessitou da sinergia das células endoteliais microvasculares, co-cultivadas com células estaminais humanas do tecido adiposo, na remodelação da matriz para uma rápida e melhor cicatrização. Numa perspectiva clínica, todas as estratégias propostas foram baseadas num princípio de produção num curto espaço de tempo, como alternativas às abordagens actuais, que exigem um longo período de tempo de preparação. Neste contexto, os constructs à base de CS foram produzidos num período de cinco dias. Por sua vez, os ECM-like constructs artificiais como foram gerados a partir de redes poliméricas off-the-shelf que, após rehidratação com suspensões celulares directamente isoladas dos tecidos ou expandidas num curto período de tempo, dão origem a spongy-like hydrogels gerados imediatamente antes da implantação. Os resultados das estratégias aqui exploradas mostraram estar fortemente associados às interacções célula-célula e célula-matriz extracelular. Além disso, a recreação arquitetónica da pele mostrou desempenhar apenas um papel secundário na eficácia das estratégias utilizadas. O potencial de células estaminais foi ainda maximizado através da promoção da interacção directa entre as células transplantadas e as células do hospedeiro.