Biochemical and molecular mechanisms of salt stress tolerance in and Olea europaea

Abstract

The current work focused in the research subject of membrane transport and plant - environment interactions and two plant models were the target of the studies: Olea europaea and Populus euphratica. Olive tree is an emblematic species and one of the most important fruit crops in the Mediterranean basin. The halophytic and salt and drought stress tolearant plant P. euphratica, which occurs naturally in semiarid areas, has recently been used as a model to study plant defense mechanisms against salt stress. In both plant species we aimed to contribute to the elucidation of the biochemical mechanisms involved in salt response, in particular those involving transmembrane transport steps of photoassimilates and tonoplast transport of protons and salt. The mechanism on how sodium is accumulated in the vacuole in response to salt in P. euphratica, and how salt stress may affect the generation and maintenance of a transmembrane proton gradient across the tonoplast were investigated. Biochemical data corroborated the involvement of Na+/H+ exchange activity in cell suspensions at the tonoplast level, whose activity increased 6-fold in NaCl-treated cells. Accordingly, confocal and epifluorescence microscopy analyses with the Na+-sensitive probe Sodium Green showed that suspension-cultured cells subjected to a salt pulse accumulated Na+ in the vacuole. In tonoplast vesicles the V-H+-PPase activity decreased with exposure to NaCl, in contrast to the observed sodium-induced increase in the activity of vacuolar H+-ATPase. The increase of both the transmembrane H+ gradient - generated by tonoplast proton pumps - and the Na+/H+ antiport activity in response to salt strongly suggested that Na+ accumulation into the vacuole contributes to salt tolerance in P. euphratica, in line with the confocal microscopy observations. In O. europaea, key biochemical and molecular steps involved in the partitioning of sugars and polyols, and how polyols may enhance salt and drought stress resistance were addressed at the protein activity and gene expression levels. Polyols are the reduced form of aldoses and ketoses, present in several species. In O. europaea leaves, mannitol was found to be the main soluble carbohydrate, followed by the monosaccharide glucose. Fructose was not detected, probably because it acted as precursor for mannitol biosynthesis. Transport experiments with [14C]mannitol showed that a polyol:H+ symport system operates in O. europaea heterotrophic cultured cells (Km = 1.3 mM). Subsequent work led to the cloning of a cDNA sequence of a mannitol carrier which was named OeMaT1 (O. europaea mannitol transporter 1). In parallel experiments, salt strongly repressed mannitol dehydrogenase activity, the first enzyme responsible for intracellular mannitol oxidation, and down-regulated OeMTD1 (O. europaea mannitol dehydrogenase 1) transcripts. This should allow for the intracellular accumulation of mannitol in order to compensate for the decrease of external water activity, thus conferring a response mechanism to salinity in O. europaea. Subsequent studies on the molecular mechanisms of glucose utilization by olive cells led to the cloning and functional characterization of the monosaccharide transporter OeMST2. Heterologous expression of this gene in Saccharomyces cerevisiae deficient in glucose transport restored its capacity to grow and to transport glucose. Transcript levels of OeMST2 increased during fruit maturation, confirming that OeMST2 catalyzes the membrane transport process of hexoses during sugar unloading in the fruits. In addition to this saturable energy dependent transport systems, in a variety of cell types, including plant cells, sugars, polyols and other solutes may be incorporated according to a diffusion-like kinetics, in spite of the real nature of this transport mechanism having been elusive. The measurement of [14C]glucose transport by cells and membrane vesicles in the presence of specific inhibitors, the measurement of activation energies of glucose uptake, among other biochemical approaches, led us to demonstrate that the low-affinity, high-capacity, diffusion-like glucose uptake in olive cells occurs through a channel-like structure whose transport capacity may be regulated by intracellular protonation and phosphorylation/dephosphorylation. The recent publication in Nature reporting the identification and functional characterization of a new class of sugar transporters, named SWEET, which are postulated to be involved in phloem transport and plant nectar production, further strengthened the involvement of low-affinity sugar facilitators in plants.

O presente trabalho focou-se no tema do transporte transmembranar de solutos em plantas, em particular no estudo dos mecanismos de transporte envolvidos na interação das plantas com o ambiente. As espécies modelo Olea europaea e Populus euphratica foram os alvos destes estudos ao nível bioquímico e molecular. A oliveira é uma espécie emblemática desde tempos ancestrais e uma das árvores de fruto mais importantes na bacia Mediterrânica. P. euphratica é uma espécie arbórea resistente ao sal e à secura, presente naturalmente em zonas semiáridas, e tem sido usada recentemente como uma planta-modelo para o estudo dos mecanismos de resistência de plantas ao stress salino. No presente trabalho tentámos contribuir para a elucidação dos mecanismos bioquímicos envolvidos na resposta de ambas as plantas à elevada salinidade, mais concretamente aqueles que envolvem o transporte transmembranar de fotoassimilados e a compartimentação no vacúolo de protões e NaCl. Em particular, foram investigados os mecanismos de compartimentação de sódio no vacúolo de P. euphratica em resposta à elevada salinidade, bem como o efeito do stresse salino na geração e manutenção de um gradiente transmembranar de protões através do tonoplasto. Os resultados mostraram o envolvimento de um sistema de antiporte do tipo Na+/H+ ao nível do tonoplasto de culturas celulares de P. euphratica, cuja actividade aumentou significativamente em células tratadas com NaCl. Estudos de microscopia confocal e de fluorescência com a sonda fluorescente Sodium Green mostraram que o NaCl se acumula no vacúolo quando as células são expostas a um pulso de sal. Em vesículas de tonoplasto purificadas de células expostas ao sal observou-se uma diminuição da actividade da bomba de protões vacuolar V-H+-PPase, contrastando com o aumento da actividade da V-H+-ATPase. No seu conjunto, os resultados sugerem que o aumento do gradiente transmembranar de H+ gerado pelas bombas de protões do tonoplasto, bem como o aumento da atividade do sistema de antiporte Na+/H+, contribuem para a acumulação de sódio no vacúolo em P. euphratica em resposta ao sal. Estas observações corroboram os resultados de microscopia confocal que mostraram a compartimentação de sódio no vacúolo. Em O. europaea foram estudados ao nível bioquímico e molecular transportadores membranares e enzimas envolvidos no metabolismo de açúcares e de polióis, no sentido de clarificar o papel dos fotoassimilados nos mecanismos de resposta à salinidade e à secura. Os polióis são formas reduzidas de aldoses e cetoses, presentes em mais de 100 espécies de plantas. Os resultados mostraram que o poliol manitol consiste no principal hidrato de carbono solúvel em folhas de O. europaea, seguido do monossacarídeo glucose. A frutose não foi detectada, provavelmente por ser utilizada como precursor biossintético de manitol. Experiências com [14C]manitol demonstraram o envolvimento de um sistema de transporte do tipo simporte poliol:H+ em culturas celulares heterotróficas de O. europaea (Km = 1.3 mM). Em paralelo, foi clonada a sequência de cDNA de um transportador de manitol, denominado OeMaT1 (O. europaea mannitol transporter 1). A adição de um pulso de sal a culturas celulares reprimiu a actividade da manitol desidrogenase, enzima responsável pelo primeiro passo de oxidação intracelular do manitol, e inibiu a transcrição do gene OeMTD1 (O. europaea mannitol dehydrogenase 1). Este mecanismo de regulação do transporte e metabolismo intracelular deve contribuir para a acumulação intracelular de manitol de modo a compensar a diminuição da actividade da água no espaço extracelular, constituindo um mecanismo de resposta à salinidade em O. europaea. Estudos subsequentes sobre os mecanismos moleculares de utilização de glucose em culturas celulares de oliveira permitiram a clonagem e caracterização funcional do transportador de monossacarídeos OeMST2. A expressão heteróloga deste gene numa estirpe mutante de Saccharomyces cerevisiae deficiente no transporte de glucose restaurou a sua capacidade de crescer em e de transportar glucose. Ao nível da planta foi observado que os níveis de transcritos do gene OeMST2 aumentam durante a maturação da azeitona, sugerindo que o OeMST2 está envolvido no descarregamento de açúcares do floema para o fruto. Diversos estudos desenvolvidos numa ampla variedade de modelos celulares têm mostrado que os açúcares, polióis e outros solutos podem ser incorporados de acordo com uma cinética de primeira ordem (do tipo difusional), para além dos mecanismos saturáveis, dependentes de energia, como os descritos neste trabalho para os transportadores de polóis e monossacarídeos. Contudo, a natureza bioquímica e molecular destes mecanismos não saturáveis permanece ainda pouco esclarecida. No presente trabalho desenvolvemos experiências de transporte com substratos radioativos em células e vesículas de membrana plasmática na presença de inibidores específicos, no sentido de procurar compreender a natureza das cinéticas de primeira ordem observadas em culturas celulares de oliveira. No seu conjunto, os resultados sugeriram o envolvimento de proteínas do tipo canal cuja capacidade de transporte pode ser regulada por protonação intracelular e fosforilação/desfosforilação. A publicação na prestigiada revista Nature sobre a recente identificação e caracterização funcional de uma nova classe de transportadores de açúcares denominada SWEET mostrou que permeases de baixa afinidade podem estar envolvidas no carregamento e descarregamento do floema.