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https://hdl.handle.net/1822/23003
Título: | Flow cytometry as a novel tool for structural and functional characterization of isolated yeast vacuoles |
Autor(es): | Rodrigues, Jorge Miguel Pires |
Orientador(es): | Côrte-Real, Manuela Gerós, H. |
Data: | 2012 |
Resumo(s): | The yeast vacuole is functionally analogous to the mammalian lysosome. Both play
important roles in fundamental cellular processes such as protein degradation,
detoxification, osmoregulation, autophagy and apoptosis which, when deregulated in
humans, can lead to several diseases. Some of these vacuolar roles are difficult to study
in a cellular context, and therefore the use of a cell-free system is an important approach
to gain further insight into the different molecular mechanisms required for vacuolar
function. The aim of this thesis was to develop a set of protocols for the structural and
functional characterization of yeast vacuoles isolated from Saccharomyces cerevisiae
using flow cytometry and several commercially available fluorescent probes. Flow
cytometry analysis was complemented by other fluorescence based thecniques, namely
fluorescence microscopy and spectrofluorimetry. The isolation protocol resulted in a
yeast vacuolar fraction with a degree of purity suitable for cytometric analysis.
Moreover, isolated vacuoles were structurally and functionally intact, and able to
generate and maintain electrochemical gradients of ions across the vacuolar membrane,
as assessed by flow cytometry. Proton and calcium gradients were dissipated by NH4Cl
and calcimycin, respectively. These results established flow cytometry as a powerful
technique for the characterization of isolated vacuoles. The protocols developed in this
study can also be used to enhance our understanding of several molecular mechanisms
underlying the development of lysosomal-related diseases, as well as of the role of the
vacuole/lysosome in different cellular processes such as apoptosis. Moreover they can
be used to screen for new drugs that modulate these processes, which have promising
clinical relevance. O vacúolo da célula de levedura é funcionalmente análogo ao lisossoma da célula de mamífero. Ambos desempenham funções importantes em processos celulares fundamentais tais como a degradação de proteínas, destoxificação, osmorregulação, autofagia e apoptose que, quando desregulada em humanos, pode levar a diversas doenças. Alguns destas funções do vacúolo são difíceis de estudar num contexto celular, e portanto a utilização de um sistema não celular é uma estratégia importante para melhor compreender os diferentes mecanismos moleculares subjacentes à função vacuolar. O objectivo desta tese foi desenvolver um conjunto de protocolos para a caracterização estrutural e funcional de vacúolos isolados da levedura Saccharomyces cerevisiae utilizando a citometria de fluxo e diversas sondas fluorescentes disponíveis comercialmente. A análise por citometria de fluxo foi complementada por outras técnicas de fluorescência, nomeadamente a microscopia de fluorescência e a espectrofluorimetria. O protocolo de isolamento utilizado na levedura permitiu a obtenção de uma fracção vacuolar com um grau de purificação apropriado para a análise citométrica. Adicionalmente, a análise por citometria de fluxo de suspensões de vacúolos isolados demonstrou que estes, após o isolamento, mantinham não só a sua integridade estrutural e funcional intactos, mas também a capacidade de gerar e manter um gradiente electroquímico de iões através da membrana vacuolar. A adição de NH4Cl e calcimicina conduziu respectivamente à dissipação do gradientes de protões e de cálcio. Estes resultados validam a exploração da citometria de fluxo como uma técnica poderosa para a caracterização de vacúolos isolados. Os protocolos desenvolvidos neste estudo podem também ser utilizados para a elucidação de diversos mecanismos moleculares associados ao desenvolvimento de doenças lisossomais, assim como do papel do vacúolo/lisossoma em diferentes processos celulares tais como a apoptose. Estes protocolos podem ainda ser utilizados para o rastreio de novas drogas que modulam estes processos e que têm relevância clínica promissora. |
Tipo: | Dissertação de mestrado |
Descrição: | Dissertação de mestrado em Biofísica e Bionanossistemas |
URI: | https://hdl.handle.net/1822/23003 |
Acesso: | Acesso aberto |
Aparece nas coleções: | BUM - Dissertações de Mestrado DBio - Dissertações de Mestrado/Master Theses |
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