Regulação e caracterização de transportes de ácidos carboxílicos em Saccharomyces cerevisiae e Candida glabrata

Abstract

Os estudos de endocitose e tráfego intracelular de proteínas da membrana plasmática, tais como transportadores e receptores em células eucariontes são de grande importância, visto que são processos altamente regulados que possuem grande relevância na fisiologia celular. Alterações nas condições ambientais (nutrientes e substratos) podem conduzir à endocitose de transportadores indesejados. O transportador de monocarboxilatos Jen1 em Saccharomyces cerevisiae tem-se revelado um excelente modelo eucarionte para dissecar geneticamente os mecanismos que regulam o tráfego intracelular de transportadores membranares, de acordo com alterações fisiológicas. Trabalhos anteriores realizados pelo nosso grupo demonstraram que a glucose induz a endocitose de Jen1, apenas em minutos, um processo dependente quer de fosforilação por Yck1, quer de ubiquitinação a cargo da ubiquitina ligase Rsp5. Este trabalho teve como objectivo estudar os mecanismos e sinais que regulam a endocitose de Jen1 em S. cerevisiae. Verificou-se que, para além da glucose, outros açúcares como a frutose e sacarose, conduziam a uma rápida internalização e degradação do transportador. Demonstrámos que a proteína Art4, pertencente a família dos adaptadores Arrestin-related trafficking (Art), é crucial para a internalização e perda de actividade de Jen1, induzida por glucose. Adicionalmente, tentámos identificar qual a via de sinalização que regula a endocitose de Jen1 após um pulso de glucose, a células crescidas em meio contendo ácido láctico. Verificou-se que Reg1, um componente da fosfatase Glc7 é essencial para a diminuição na actividade de Jen1, ao contrário do que se verifica para o sensor de glucose Gpr1. Numa outra vertente deste trabalho investigámos a capacidade de Candida glabrata, a segunda levedura patogénica mais prevalente em humanos, crescer em meios com diferentes fontes de carbono, nomeadamente meios contendo ácidos carboxílicos. Estes estudos fisiológicos foram estendidos a duas estirpes interrompidas em genes potencialmente codificantes para transportadores de ácido acético. Os resultados obtidos mostraram que a fonte preferencial de carbono em C. glabrata é a glucose e que todas as estirpes estudadas possuem dificuldade de crescimento em meio contendo ácido acético a pH 5,0. Esta caracterização constituiu uma base essencial para trabalhos futuros nesta levedura.

Studies on the endocytosis and intracellular traffic of plasma membrane proteins such as transporters and receptors in eukaryotes cells are very important since they are highly regulated processes and very relevant to the cell physiology. The monocarboxylate transporter Jen1 of Saccharomyces cerevisiae, has proven to be an excellent eukaryotic model for genetically dissecting mechanisms that regulate intracellular trafficking of plasma membrane proteins, in response to physiological constraints. Previous work carried out by our group, demonstrated that glucose induces downregulation of Jen1 within minutes, a process dependent both on phosphorylation by Yck1 and ubiquitylation, carried out by the ubiquitin ligase Rsp5. One of the main goals of this work was to study the mechanisms and signals that regulate Jen1 endocytosis in S. cerevisiae. It was demonstrated that, in addition to glucose, other sugars such as fructose and sucrose trigger a rapid internalization and degradation of the transporter. We demonstrated that the protein Art4, belonging to the family of Arrestin-related trafficking proteins (Art) is crucial for Jen1 glucose induced downregulation. Additionally, we attempted to identify the signaling pathway that regulates Jen1 endocytosis, after a pulse of glucose to cells grown in a lactic acid containing media. We have shown that Reg1, a component of the Glc7 phosphatase, is essential for Jen1 downregulation, in contrast to what is observed for the glucose sensor Gpr1. In another scope of this work, we have studied the ability of Candida glabrata, the second most prevalent pathogenic yeast in humans, to grow in media containing different carbon sources, namely in media containing carboxylic acids. These physiological studies were extended to two other strains deleted in genes potentially coding for acetic acid transporters. The results obtained show that glucose is the preferential carbon source in C. glabrata and that all the studied strains have difficulties in growing in media containing acetic acid at pH 5,0, as the sole carbon and energy source. This physiological characterization is an essential base of study for future work.