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https://hdl.handle.net/1822/14054
Título: | Insights into Candida tropicalis virulence factors |
Autor(es): | Gossi, Melyssa Fernanda Norman Negri |
Orientador(es): | Oliveira, Rosário Henriques, Mariana |
Data: | 22-Jul-2011 |
Resumo(s): | Candida
tropicalis
is
a
common
species
related
to
nosocomial
infections,
namely
candidemia
and
candiduria.
Several
virulence
factors
seem
to
be
responsible
for
C.
tropicalis
infections,
which
present
high
potential
for
dissemination
and
mortality.
Adhesion
to
surfaces
(medical
devices
and
host
cells)
and
biofilm
formation,
are
considered
important
factors
that
contribute
to
the
development
of
candidosis.
Hence,
the
colonization
of
indwelling
devices
like
urinary
catheters
by
C.
tropicalis
poses
a
critical
problem.
Further,
adhesion
and
invasion
of
host
cells
by
C.
tropicalis
is
considered
the
first
step
to
initiate
systemic
infections.
Once
adhered
to
epithelium,
C.
tropicalis
are
able
to
secrete
hydrolytic
enzymes
that
cause
damage
in
host
cells
membrane
integrity,
leading
to
dysfunction
or
disruption
of
host
structures.
Thus,
the
main
aim
of
this
work
was
to
characterize
the
virulence
factors
of
C.
tropicalis
as
well
as
to
evaluate
adhesion
to
biotic
and
abiotic
surfaces,
biofilm
formation,
expression
of
hydrolytic
enzymes
and
antifungal
susceptibility
of
C.
tropicalis
clinical
isolates
from
urine
and
blood
cultures
and
from
central
venous
catheters.
Accordingly,
in
order
to
enhance
the
knowledge
in
the
process
of
C.
tropicalis
adhesion
and
consequent
biofilm
formation
in
urinary
catheters,
the
first
goal
of
this
research
was
to
develop
an
in
vitro
dynamic
model,
with
silicone
and
latex
urinary
catheters,
using
artificial
urine
(AU).
Moreover,
Candida
surface
hydrophobicity
was
also
evaluated,
as
well
as
the
biofilm
matrix
content
in
terms
of
proteins
and
carbohydrates.
So,
this
model
using
AU
was
shown
to
be
suitable
for
studies
mimicking
the
real
body
conditions.
Additionally,
C.
tropicalis
was,
in
fact,
able
to
colonize
both
urinary
catheters
in
the
presence
of
AU
and
to
detach
from
these
catheters
and
move
against
the
flow,
demonstrating
their
ability
to
colonize
distal
sites.In
vitro
studies
for
the
assessment
of
yeast
cells
adhesion
capability
to
host
tissues
are
essential
to
characterise
the
virulence
of
Candida
species.
However,
the
assessment
of
the
number
of
adhered
yeast
cells
by
traditional
methods
is
time
consuming.
Therefore,
a
simple
methodology,
using
crystal
violet
staining,
was
developed
to
quantify
in
vitro
adhesion
of
different
Candida
species
to
epithelial
cells.
The
method
was
validated
for
the
different
Candida
reference
strains
of
different
species
by
comparison
with
traditional
microscope
observation
and
enumeration.
The
proposed
technique
is
easy
to
perform
and
reproducible,
enabling
the
determination
of
adhesion
ability
of
Candida
species
to
an
epithelial
cell
line.
After
standardizing
the
methodologies
to
evaluate
Candida
adhesion
ability,
the
next
step
was
the
characterization
of
C.
tropicalis
virulence,
by
assessing
antifungal
susceptibility
and
comparing
the
expression
of
several
virulence
factors.
Regarding
adhesion,
it
can
be
highlighted
that
C.
tropicalis
strains
adhered
in
significantly
higher
number
to
epithelium
than
to
silicone.
Furthermore,
all
C.
tropicalis
strains
were
able
to
form
biofilms
and
to
express
total
haemolytic
activity.
However,
protease
and
phospholipase
positive
response
were
detected
only
in
few
isolates
but
from
different
sites
of
isolation.
All
isolates
were
susceptible
to
voriconazole,
fluconazole
and
amphotericin
B.
Four
strains
were susceptible-‐dose
dependent
to
itraconazole
and
one
clinical
isolate
was
found
to
be
resistant
to
this
agent.
Then,
it
was
investigated
the
interaction
of
C.
tropicalis
with
three
different
human
cell
lines:
TCC-‐SUP
(epithelial
cells
from
urinary
bladder);
HeLa
(epithelial
cells
from
cervical
carcinoma)
and
Caco-‐2
(epithelial
cells
from
colorectal
adenocarcinoma).
Specifically,
the
degree
of
human
cells
damage
and
activity
reduction
induced
by
C.
tropicalis
adhesion
and
the
role
of
Candida
tropicalis
aspartyl
proteinases
(SAPT)
genes
expression
in
this
process
were
assessed.
It
was
possible
to
observed
that
C.
tropicalis
strains
were
able
to
adhere
to
the
different
human
cells,
although,
in
a
strain
and
cell
dependent
manner.
Concerning
human
cells
response
to
C.
tropicalis,
the
highest
cell
activity
inhibition
was
obtained
for
Caco-‐2,
followed
by
TCC-‐SUP
and
HeLa
cells.
C.
tropicalis
strains
in
contact
with
the
different
types
of
epithelial
cells
exhibited
a
wide
range
of
expression
profiles
of
SAPT
genes,
however,
SAPT3
was
the
gene
expressed
in
a
higher
level.
Finally,
it
was
studied
the
behaviour
of
C.
tropicalis
in
biofilms
of
different
ages
(24-‐120
h)
formed
in
artificial
urine
(AU)
and
their
effect
in
human
urinary
bladder
cells
(TCC-‐SUP).
A
similar
profile
in
metabolic
activity
along
biofilm
age
was
found
among
strains,
with
an
increase
from
72
to
96
h
and
a
decrease
from
96
to
120
h.
Candida
tropicalis
biofilm
cells
were
able
to
adhere
to
TCC-‐SUP
cells,
in
general,
independently
of
biofilm
age.
Yeasts
affected
TCC-‐SUP
cells,
with
difference
among
biofilms
and
strains.
Generally,
SAPT3
was
highly
expressed
in
comparison
with
other
SAPT
genes. In
summary,
C.
tropicalis
strains
were
able
to
form
biofilms
in
AU,
in
static
or
dynamic
mode,
although,
with
differences
among
strains.
It
is
important
to
emphasize
that
human
cells
response
to
C.
tropicalis
adhesion,
as
well
as
SAPs
production,
is
strain
and
epithelial
cell
line
dependent.
Additionally,
it
should
be
highlighted
that
C.
tropicalis
cells
detached
from
biofilms
are
able
to
colonize
human
cells
and
cause
some
injury
and
reduction
of
metabolic
activity.
Generally,
SAPT3
was
highly
expressed
compared
to
other
SAPT
genes. Candida tropicalis é uma espécie comummente relacionada com infecções nosocomiais, tais como, candidemia e candidúria. Vários fatores de virulência parecem ser responsáveis por infecções por C. tropicalis, que apresentam elevado potencial de disseminação e mortalidade. A adesão às superfícies (dispositivos médicos e células do hospedeiro) e a formação de biofilmes, são considerados factores importantes que contribuem para o desenvolvimento de candidose. Assim, a colonização do interior de cateteres urinários por C. tropicalis representa um problema crítico. Além disso, adesão e invasão das células hospedeiras por C. tropicalis é considerado o primeiro passo para iniciar infecções sistémicas. Uma vez aderidas ao epitélio, as células de C. tropicalis são capazes de excretar enzimas hidrolíticas que causam danos da membrana de células do hospedeiro. Assim, o objetivo principal deste trabalho foi caracterizar os factores de virulência de C. tropicalis, incluindo a avaliação da adesão às superfícies bióticas e abióticas, formação de biofilme, a expressão de enzimas hidrolíticas e suscetibilidade aos antifúngicos Assim, a fim de aumentar o conhecimento no processo de adesão de C. tropicalis e consequente formação de biofilme em cateteres urinários, o primeiro objetivo deste trabalho foi desenvolver um modelo dinâmico in vitro, com cateteres urinários de silicone e látex, com urina artificial (UA). Além disso, hidrofobicidade superficial de Candida também foi avaliada, assim como o conteúdo da matriz do biofilme, em termos de proteínas e hidratos de carbono. Assim, este modelo mostrou-‐se adequado para estudos simulando as condições reais do corpo. Além disso, C. tropicalis foi, de facto, capaz de colonizar os cateteres urinários na presença de UA e destacar a partir desses cateteres e mover contra o fluxo imposto, demonstrando sua capacidade de colonizar locais mais distais. Apesar de ser fundamental desenvolver estudos in vitro para a avaliação da capacidade de adesão de leveduras aos tecidos, a avaliação do número de células de leveduras aderidas por métodos tradicionais é demorada. Assim tornou-‐se necessário desenvolver uma metodologia simples, utilizando uma coloração com violeta cristal para quantificar a adesão in vitro de diferentes espécies de Candida a células epiteliais. O método foi validado para diferentes espécies de Candida e foi feita a comparação com a enumeração por observação ao microscópio. A técnica proposta é de fácil execução e reprodutível, permitindo a determinação da capacidade de adesão das espécies de Candida a uma linha de células epiteliais. Um outro objetivo do presente trabalho foi a caracterização da virulência de C. tropicalis, através da avaliação da susceptibilidade aos antifúngicos e comparação com a expressão de factores de virulência. Verificou-‐se que as estirpes de C. tropicalis aderiram em número significativamente superior ao epitélio do que ao silicone, foram capazes de formar biofilmes e de manifestar atividade hemolítica total. No entanto, a protease e a fosfolipase foram detectadas apenas em alguns isolados. Todos os isolados foram susceptíveis ao voriconazol, fluconazol e anfotericina B. Quatro estirpes foram susceptíveis dose dependente ao itraconazol e um isolado clínico foi resistente a este agente. Em seguida, foi investigada a interação de C. tropicalis com três linhas celulares humanas diferentes: TCC-‐SUP (células epiteliais da bexiga); HeLa (células epiteliais de carcinoma do colo do útero) e Caco-‐2 (células epiteliais do adenocarcinoma colorretal). Especificamente, foram avaliados o grau de lesão das células humanas induzida por C. tropicalis e o papel da expressão do gene aspartil protease (SAPT), neste processo. Foi possível observar que as estirpes de C. tropicalis foram capazes de aderir às diferentes células humanas, embora de forma dependente da linha celular e da estirpe. Quanto à resposta de células humanas, verificou-‐se uma maior inibição de atividade celular em Caco-‐2, seguido de TCC-‐SUP e HeLa. As estirpes de C. tropicalis em contato com os diferentes tipos de células epiteliais apresentaram uma ampla variedade de perfis de expressão de genes SAPT, no entanto, SAPT3 foi o gene expresso em maior quantidade. Por fim, foi estudado o efeito de biofilmes de C. tropicalis (24-‐120 h), formados em UA, em células TCC-‐SUP. Foi então detetado um perfil semelhante na atividade metabólica dos biofilmes das diferentes estirpes, com um aumento das 72 h para as 96 h, e uma diminuição das 96h para as 120 h. De um modo geral, as células de C. tropicalis provenientes dos biofilmes foram capazes de aderir a células TCC-‐SUP, independentemente da idade do biofilme. As leveduras afetaram as células TCC-‐SUP, com diferenças entre os biofilmes e as estirpes. Em geral, o gene SAPT3 foi mais expresso em comparação com outros genes SAPT. Em resumo, as estirpes de C. tropicalis estudadas foram capazes de formar biofilmes na UA, no modo estático ou dinâmico, embora com diferenças entre as estirpes. É importante ressaltar que a resposta de células humanas para à adesão C. tropicalis, bem como a produção de SAPTs, é dependente da estirpe e da linha celular. Além disso, deve-‐se ressaltar que as células de C. tropicalis isoladas de biofilmes são capazes de colonizar as células humanas e causar alguma lesão e redução da atividade metabólica. Em geral, o gene SAPT3 foi o mais expresso. |
Tipo: | Tese de doutoramento |
Descrição: | Tese de doutoramento em Engenharia Biomédica |
URI: | https://hdl.handle.net/1822/14054 |
Acesso: | Acesso aberto |
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