Influence of humic substances on biofilm structure and its microbial diversity in natural waters

Abstract

Natural organic matter (NOM) is ubiquitous in terrestrial and aquatic ecosystems; it comprises an important source of carbon for river biofilms which are major sites of carbon cycling in streams. NOM may be classified in two main categories: non-humic and humic substances (HSs). About 75 % of the dissolved organic carbon (DOC) in rivers results from HSs. The presence of HSs in water treatment plants is undesirable because they increase coagulant and disinfectant demands, and in the presence of chlorine may provoke the formation of dangerous disinfection by-products such as the carcinogenic trihalomethanes (THM). A good knowledge of HSs involvement on biofilm growth can contribute to the development of a biological alternative of HSs removal from rivers. The first step of this work consisted on characterization of HSs and comparison of two methods, combustion-infrared method and UV spectroscopy method, commonly used to HSs quantification in aqueous solution. In this study were evaluated the effect of divalent cations (calcium and magnesium) concentrations, pH and, sample filtration on HSs quantification from simulated river water. A commercial humic acid (HA) was used to simulate HSs. The experimental results demonstrate that unfiltered samples presented considerably higher total organic carbon (TOC) values than filtered ones, independently of the method used. Based on these results, it can be suggested that a considerable amount of HAs was present as colloids with an average diameter higher than 0.45 μm. TOC values of unfiltered samples obtained by both methods were considerably different for all pH values and cation concentrations tested. TOC values obtained by the combustioninfrared method were closer to the concentration of the HAs suspension which was prepared by weighting a defined amount of HAs. The combustion-infrared method gave the most accurate value although the precision was lower than the one obtained in the UV spectroscopy method. In this regard, the combustion-infrared method is recommended for HSs quantifications in surface water where pH values and divalent cation concentration may vary considerably. Since biofilms are major sites of carbon transformations in rivers, biofilm formation on HSs was studied using simulated river water and model biofilm flowcells to obtain controlled hydrodynamic conditions. Biofilm formation in the presence HSs as a carbon source under a flow velocity of 0.04 m/s was evaluated. Two biofilm flowcells were operated in parallel; one with synthetic stream water, displaying a background carbon concentration of 1.3 ± 0.8 mg/L, the other with added HSs and an overall carbon concentration of 9.7 ± 1.0 mg/L. From the biofilms’ results of culturable and total countable cells, it can be concluded that the presence of HSs did not significantly enhance the biofilm density. However, the biofilm formed in the presence of HSs presented slightly higher values of volatile suspended solids (VSS) and protein. One possible explanation for this result is that HSs adsorbed to the polymeric matrix of biofilm and were included in the quantification of VSS and protein. The bacterial community of biofilms formed with and without HSs was different. In the biofilm with HSs were identified bacteria belonging to beta-Proteobacteria (represented by Cupriavidus metallidurans and several species of the genus Ralstonia) and gamma-Proteobacteria (represented by Escherichia coli). In the biofilm formed without HSs were identified bacteria of groups beta-Proteobacteria (represented by Variovorax paradoxus) and Bacteroidetes. Flow velocity, concentration and nature of carbon source are of great importance on the biofilm development. Thus, in the last work it was investigated the response of biofilms formed with and without HSs to an increase in flow velocity (0.04 to 0.10 m/s) and HSs concentration (9.7 ± 1.0 to 19.8 ± 0.4 mg/L). The highest biofilm density, according to VSS and total countable cells, was detected at 0.10 m/s without HSs. In this regard, organic carbon present in distilled water and in HSs may have not the same bioavailability. HSs concentration had no significant effects on biofilm cell density under different flow velocities. However, HSs presence influenced the biofilm bacteria composition. Sequences retrieved from biofilms formed in the presence of HSs were related (similarities ≥ 97 %) to Dokdonella genus which belongs to gamma-Proteobacteria and to Comamonas, Cupriavidus and Ralstonia genera which belong to beta-Proteobacteria. Sequences retrieved from the biofilm without HSs were related (similarities ≥ 97 %) to Sphingomonas and Nitrosospira genera that belong to alpha-Proteobacteria and beta-Proteobacteria, respectively. In conclusion, based on this work an increased understanding was gained of HSs effects on biofilm formation under different hydrodynamic conditions, however additional studies are needed to quantify HSs biodegradability in biofilms.

A material orgânica natural (MON) é ubíqua em ecossistemas terrestres e aquáticos e constitui uma fonte de carbono importante para os biofilmes, presentes nos rios, que são os principais responsáveis pelo ciclo do carbono. A MON pode ser classificada em duas categorias principais: substâncias não húmicas e substâncias húmicas (SHs). Nas águas superficiais aproximadamente 75 % do carbono orgânico dissolvido (COD) resulta das SHs. A presença de SHs nas estações de tratamento de água é indesejável porque aumenta a necessidade de adição de coagulantes e desinfectantes e na presença de cloro pode conduzir à formação de subprodutos de desinfecção, nomeadamente, trihalometanos (THM) que são compostos carcinogénicos. Um bom conhecimento da contribuição das SHs no crescimento dos biofilmes pode conduzir ao desenvolvimento de uma alternativa biológica para a remoção das SHs das águas superficiais. O primeiro passo deste trabalho consistiu na caracterização das SHs e comparação de dois métodos, método combustão e detecção de infravermelhos e método espectrofotométrico, frequentemente utilizados na quantificação de SHs em solução aquosa. Neste estudo foram avaliados os efeitos da concentração dos iões divalentes (cálcio e magnésio), pH e filtração da amostra na quantificação das SHs de água de rio sintética. Foi utilizado ácido húmico (AH) comercial para simular SHs. Os resultados experimentais demonstraram que as amostras não filtradas apresentaram valores de carbono orgânico total (COT) consideravelmente superiores aos valores das amostras filtradas, independentemente do método utilizado. Com base nestes resultados, pode sugerir-se que uma quantidade considerável de AHs estava presente em forma de colóides com um diâmetro, em média, superior a 0.45 μm. Os valores de COT das amostras não filtradas obtidos pelo método de combustão e detecção de infravermelhos estavam mais próximos da concentração dos AHs que foi preparada com a pesagem de uma quantidade definida de AH. O método de combustão e detecção de infravermelhos apresentou o valor mais exacto apesar da precisão ter sido inferior ao valor obtido pelo método espectrofotométrico (UV). Neste sentido, o método de combustão e detecção de infravermelhos é recomendado para a quantificação de SHs em águas superficiais cujos valores de pH e concentração de catiões divalentes podem variar consideravelmente. Uma vez que os biofilmes são os principais locais de transformação de carbono nos rios, foi estudada a formação de biofilme na presença de SHs utilizando-se água de rio sintética e células de fluxo modelo de modo a obter condições hidrodinâmicas controladas. Foi avaliada a formação de biofilme na presença de SHs como fonte de carbono à velocidade de 0.04 m/s. Foram operadas duas células de fluxo em paralelo; uma com água sintética de rio, contendo uma concentração “background” de carbono de 1.3 ± 0.8 mg/L, outra com a adição de SHs e, geralmente, com concentração de carbono de 9.7 ± 1.0 mg/L. A partir dos resultados das células cultiváveis e das células totais contáveis, pode-se concluir que a presença de SHs não favoreceu significativamente a densidade celular do biofilme. No entanto, o biofilme formado na presença de SHs apresentou valores de sólidos suspensos voláteis (SSV) e de proteína ligeiramente superiores. Uma explicação possível para este resultado consiste no facto das SHs terem adsorbido à matriz polimérica do biofilme e terem sido incluídas na quantificação dos SSV e proteína. A comunidade bacteriana dos biofilmes formados com e sem SHs foi diferente. No biofilme com SHs foram identificadas bactérias que pertencem aos grupos beta-Proteobacteria (representado pela espécie Cupriavidus metallidurans e algumas espécies do género Ralstonia) e gamma-Proteobacteria (representado pela espécie Escherichia coli). No biofilme formado sem SHs foram identificadas bactérias dos grupos beta-Proteobacteria (representado pela espécie Variovorax paradoxus) e Bacteroidetes. A velocidade, concentração e natureza da fonte de carbono têm elevada importância no desenvolvimento do biofilme. Deste modo, no último trabalho foi investigada a resposta dos biofilmes formados com e sem SHs a um aumento de velocidade (0.04 para 0.10 m/s) e concentração de SHs (9.7 ± 1.0 para 19.8 ± 0.4 mg/L). A densidade celular de biofilme mais elevada, de acordo com os resultados dos SSV e células totais contáveis, foi detectada a 0.10 m/s sem SHs. Neste sentido, o carbono orgânico presente na água destilada e nas SHs pode não ter a mesma biodisponibilidade. A concentração de SHs não teve efeitos significativos na densidade celular do biofilme sob diferentes velocidades. No entanto, a presença de SHs influenciou a composição bacteriana do biofilme. Sequências obtidas a partir de biofilmes formados na presença de SHs foram relacionadas (similaridades ≥ 97 %) com o género Dokdonella que pertence ao grupo gamma-Proteobacteria e com os géneros Comamonas, Cupriavidus e Ralstonia que pertencem ao grupo beta-Proteobacteria. Sequências obtidas a partir de biofilme sem SHs foram relacionadas (similaridades ≥ 97 %) com os géneros Sphingomonas e Nitrosospira que pertencem, respectivamente, aos grupos alpha-Proteobacteria e beta-Proteobacteria. Em conclusão, com base neste estudo, aumentou-se o conhecimento dos efeitos das SHS na formação de biofilmes sob diferentes condições hidrodinâmicas, no entanto são necessários estudos adicionais para quantificar a biodegradabilidade das SHs nos biofilmes.