Efeitos do secretoma de células estaminais do cordão umbilical em populações de neurónios hipocampais, cerebelares e corticais

Abstract

Foi recentemente demonstrado que células estaminais ‘tipo mesenquimais’ isoladas a partir da geleia de Wharton do cordão umbilical humano, nomeadamente células perivasculares do cordão umbilical humano (HUCPVCs), podem ser usadas como um possível agente terapêutico para o tratamento de doenças associadas com o sistema nervoso central (SNC), essencialmente através do seu secretoma. O objectivo do presente trabalho foi avaliar os efeitos dos meios condicionados (MC) das HUCPVCs em diferentes populações neuronais, isoladas a partir de diferentes áreas cerebrais, nomeadamente do hipocampo, córtex e cerebelo. As HUCPVCs foram isoladas a partir do tecido conjuntivo do cordão umbilical e colocadas em cultura a uma densidade de 4000 células/cm2. Após 3 dias em cultura, o meio foi renovado e recolhido após 24h, 48h, e 96h. As diferentes culturas (hipocampais, corticais e cerebelares) foram isoladas a partir de ratos wistar P4, e expostas ao MC das HUCPVCs durante 7 dias. Culturas controlo foram incubadas com meio standard (Neurobasal). A viabilidade metabólica foi avaliada com teste de MTS e a proliferação celular através de uma incubação com BrdU durante 24h do sexto para sétimo dia de cultura. As contagens celulares foram realizadas após imunocitoquímica para MAP-2 (neurónios) e GFAP (astrócitos). Os resultados revelam que nas culturas hipocampais o MC das 96h induz um aumento na viabilidade metabólica e proliferação celular. Efeitos semelhantes foram observados nas culturas corticais, onde o MC 96h induz um aumento cerca de 6 vezes, quando comparado com o controlo. De referir que nas culturas corticais não foram observadas células nos controlos, enquanto que nas culturas incubadas com os MC se observa um aumento na percentagem de neurónios. Relativamente às culturas cerebelares, o valor mais elevado na viabilidade metabólica foi observado com o MC 24h, enquanto que o MC 48h induz maiores níveis de proliferação celular e percentagem de células positivas para MAP-2. A partir destes resultados torna-se evidente que os MC, e consequentemente o secretoma de HUCPVCs induzem diferentes efeitos nas culturas neuronais isoladas de diferentes áreas cerebrais. Possivelmente isto é devido a expressão de factores neuroreguladores que modulam a sobrevivência celular. Uma análise efectuada por bioplex, revelou a presença de bFGF, VEGF, b- NGF, SCF e HGF, que pode em parte explicar alguns dos efeitos observados. Contudo, dados adicionais são necessários pela utilização de novas técnicas, como electroforese 2D e espectrometria de massa, tendo em vista a detecção de outros factores que possam estar envolvidos nestes processos.

Recent studies have shown that mesenchymal like adult stem cells isolated from umbilical cord’s Wharton Jelly, namely Human Umbilical Cord Perivascular Cells (HUCPVCs) might be used as possible therapeutical agents to treat disorders associated to the central nervous system (CNS). It has been hypothesized that their secretome may play a role on these effects. Therefore the aim of the present work was to understand the effects of conditioned media (CM) and thus HUCPVCs secretome on populations of neurons, isolated from different areas in the brain, namely hippocampus, cortex and cerebellum. HUCPVCs were isolated from the primitive connective tissue present in the umbilical cord and further cultured at 4000cells/cm2. On day 3 the medium was replaced and 24h, 48h and 96h thereafter HUCPVCs CM was collected. The diverse neuronal populations (hippocampal, cortical and cerebellar) were isolated from P4 newborn Wistar rats. Upon isolation they were exposed to HUCPVCs CM for 7 days. Control cultures were incubated with standard medium (Neurobasa). Cell viability was assayed by the MTS test while cell proliferation was assessed by a 24h BrdU incubation from days 6 to 7. Cell counts were performed on immunostained cultures for MAP-2 (neurons) and GFAP (astrocytes). For hippocampal neurons CM 96h lead to an increase of the metabolic viability and cell proliferation. Similar effects were also found for cortical neurons. In this particular case CM 96h incubation lead to a six fold increase when compared to controls. Important to mention is that in control cultures no cortical neurons could be observed, while in cultures incubated with CM it was observed an increase in percentage of cortical neurons. Concerning cerebellar cultures the highest value of metabolic viability was observed with CM 24h whereas CM 48h induced higher levels of cell proliferation and MAP-2 positive cells. From these results it is obvious that HUCPVCs CM leads to different effects on post-natal neurons from different sources. These effects are probably related with the expression of neuroregulatory factors. Bioplex analysis revealed the presence of bFGF, VEGF, b-NGF, SCF e HGF. Therefore it is essential to generate more data using new methodologies, such 2D electrophoresis and mass spectrometry to detect non - traditional factors that can be involved in this processes.